玉屏風散對變應性鼻炎模型小鼠肥大細胞成熟及活化的影響

陸越悅 何晗昳 滕堯樹 金衛東

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是機體暴露于變應原后主要由免疫球蛋白E（IgE）介導的鼻黏膜非感染性慢性炎癥，已成為主要的呼吸道慢性炎癥疾病。流行病學調查顯示，全球AR 患者人數超過5億，患病率為10%～25%[1]。肥大細胞能產生Th2 型細胞因子，誘導B 細胞IgE 合成，并能通過肥大細胞-IgE-高親和力受體（FcεRI）級聯自我激活，在AR 的發病中起著重要作用[2]。研究表明，玉屏風散具有廣泛的免疫調節作用，調控包括肥大細胞在內的多種免疫細胞，被廣泛用于治療支氣管哮喘、AR 及呼吸道反復感染等疾病，但其藥物作用機制復雜，目前尚不完全清楚[3-4]。本研究通過玉屏風散干預卵白蛋白（ovalbumin，OVA）制備的AR 模型，探索玉屏風散對AR 小鼠肥大細胞分化、成熟及活化的影響。

1 實驗材料

1.1 動 物 BALB/c 近交系小鼠30 只，雄性，8～10周齡，體質量約25.0g，SPF 級。購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005，合格證號：20170005036437。飼養環境：溫度范圍20～25℃，相對濕度范圍40%～70%。飲用水為滅菌二級超純水。實驗動物使用許可證號為SYXK（浙）2015-0008。本實驗通過實驗動物倫理審批（審批編號：HB201601208）。

1.2 玉屏風散配置 按《中華人民共和國藥典》的標準配置玉屏風散[5]。取黃芪300g，白術、防風各100g（比例3∶1∶1），加水3000mL（按每克生藥加水6mL），冷水浸泡30min，煮沸后再文火慢煎40min，趁熱過濾，濾液自然滴盡；二煎加水2000mL（按每克生藥加水4mL），煮沸后，文火慢煎40min，趁熱過濾濾液，自然滴盡。混合2 次濾液，濃縮配成1.0g/mL 的玉屏風散水煎液，置4℃冰箱備用。

1.3 主要試劑 OVA（美國Sigma 公司，批號SLBQ 9036V），氫氧化鋁Al（OH）3（上海凌峰化學試劑有限公司，批號20120629），組胺酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號JL10420），白介素-13（IL-13）ELISA 檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號SEKM-0014），甲苯胺藍染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號G3663），兔抗小鼠類胰蛋白酶單克隆抗體（美國Abcam 公司，批號ab151757），酶標山羊抗兔IgG 二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號PV-6001），Anti-mouse CD117-FITC 抗體（美國Biolegend 公司，批號105816），Anti-mouseFcεRI-APC 抗體（美國Biolegend 公司，批號134316），紅細胞裂解液（杭州聯科生物技術有限公司，批號MR0504-500）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模 將30 只BALB/c 近交系小鼠適應性飼養1 周后，按隨機數字表法分為正常對照組、AR 模型組和玉屏風散組，每組10 只。致敏階段：AR模型組和玉屏風散組均于第0、7、14 天腹腔注射OVA（25μg）+Al（OH）3（1mg）混懸液0.2mL，正常對照組按上述方法腹腔注射生理鹽水0.2mL。激發階段：從第21～27 天（共連續7 天）分別對AR 模型組和玉屏風散組用OVA（25mg/mL）進行滴鼻激發，每天1次，每次20μL，正常對照組則用等量生理鹽水滴鼻。玉屏風散干預階段：玉屏風散組于激發前1 天開始用玉屏風散水煎劑灌胃（25g·kg-1·d-1）治療，連續8天，正常對照組和AR 模型組則用等量生理鹽水灌胃。

2.2 行為學觀察 末次激發后，觀察15min 內小鼠噴嚏、撓鼻和流涕，并進行評分，采用疊加量化記分法計算總分，從而評估各組AR 發病率及嚴重程度，評分標準見表1[6]。

表1 小鼠鼻部癥狀評分標準

2.3 ELISA 檢測血漿組胺和IL-13 水平 末次激發后24h，摘除小鼠眼球取血，置于肝素抗凝管中，室溫下靜置1h，離心（離心半徑13.49cm，轉速3500r/min）10min，取上清為待測血漿。按照ELISA 檢測試劑盒說明書測定血漿組胺和IL-13 水平。

2.4 甲苯胺藍染色檢測鼻黏膜肥大細胞浸潤 末次激發后24h，將小鼠脫頸椎處死，取下含鼻腔的小鼠頭部，用4%多聚甲醛4.0℃固定24h，然后用10%EDTA 緩沖液脫鈣28 天，隔日換液，最后將標本進行石蠟包埋、切片。根據試劑盒說明書進行甲苯胺藍染色10～15min，0.5%冰乙酸分化，直到細胞核和顆粒清晰可見。計數3 個高倍鏡下鼻黏膜組織切片中肥大細胞數量的平均值，評估肥大細胞浸潤情況。

2.5 免疫組織化學染色檢測鼻黏膜類胰蛋白酶表達將鼻腔組織的石蠟切片脫蠟水化，經高壓修復抗原后加兔抗小鼠類胰蛋白酶單克隆抗體，4℃孵育過夜，用酶標山羊抗兔IgG 二抗37℃孵育30min，DBA顯色，蘇木素復染。每組隨機取3 個視野，用Image-Pro Plus 測量樣本免疫組化陽性表達平均光密度值。

2.6 流式細胞儀檢測骨髓細胞表面標志物CD117、FcεRI 表達 末次激發后24h，取小鼠股骨和脛骨，以1mL 注射器針頭反復沖洗骨髓腔，收集細胞懸液，200 目篩網過濾，獲取單細胞懸液，離心（離心半徑14cm，轉速1000r/min）5min，獲取細胞沉淀，加入3mL 紅細胞裂解液重選細胞，室溫裂紅5min，離心5min，棄去上清，每支離心管再加入2mL 紅細胞裂解液；離心5min，棄去上清，1mL 1640 培養基重懸骨髓細胞。按操作說明書加入Anti-mouse CD117-FITC抗體和Anti-mouse FcεRI-APC 抗體，4℃避光孵育30min。使用流式細胞儀檢測CD117 和FcεRI 雙陽性細胞。

2.7 統計學方法 應用SPSS 16.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩采用Bonferroni法。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 玉屏風散對AR 模型小鼠撓鼻和噴嚏的影響與正常對照組比較，AR 模型組小鼠的撓鼻、噴嚏及流清涕評分和鼻部癥狀總評分均顯著增加（P＜0.05）；與AR 模型組比較，玉屏風散組可明顯改善小鼠的撓鼻、噴嚏及流清涕評分和鼻部癥狀總評分，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠AR 鼻部癥狀評分比較（分，）

表2 各組小鼠AR 鼻部癥狀評分比較（分，）

注：正常對照組及AR 模型組給予等量生理鹽水灌胃；玉屏風散組給予玉屏風散水煎劑（25g·kg-1·d-1）灌胃；AR 為變態性鼻炎；與正常對照組比較，aP＜0.05；與AR 模型組比較，bP＜0.05

3.2 玉屏風散對AR 模型小鼠血漿組胺和IL-13 水平的影響 與正常對照組比較，AR 模型組小鼠血漿組胺和IL-13 水平顯著增加（P＜0.05）；與AR 模型組比較，玉屏風散組可明顯降低小鼠血漿中組胺和IL-13 的水平，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血漿組胺和IL-13 水平比較（）

表3 各組小鼠血漿組胺和IL-13 水平比較（）

注：正常對照組及AR 模型組給予等量生理鹽水灌胃；玉屏風散組給予玉屏風散水煎劑（25g·kg-1·d-1）灌胃；AR 為變態性鼻炎；IL-13 為白介素-13；與正常對照組比較，aP＜0.05；與AR 模型組比較，bP＜0.05

3.3 玉屏風散對AR 模型小鼠鼻黏膜組織肥大細胞浸潤的影響 各組小鼠鼻黏膜組織經甲苯胺藍染色，肥大細胞呈藍紫色。與正常對照組比較，AR 模型組鼻黏膜組織中肥大細胞數量增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與AR 模型組比較，玉屏風散組鼻黏膜組織肥大細胞數量則顯著降低（P＜0.05）。見表4，圖1。

表4 各組小鼠鼻黏膜組織肥大細胞數量及類胰蛋白酶表達比較（）

表4 各組小鼠鼻黏膜組織肥大細胞數量及類胰蛋白酶表達比較（）

注：正常對照組及AR 模型組給予等量生理鹽水灌胃；玉屏風散組給予玉屏風散水煎劑（25g·kg-1·d-1）灌胃；AR 為變態性鼻炎；與正常對照組比較，aP＜0.05；與AR 模型組比較，bP＜0.05

圖1 各組小鼠鼻黏膜組織甲苯胺藍染色（×400）

3.4 玉屏風散對AR 模型小鼠鼻黏膜組織類胰蛋白酶表達的影響 與正常對照組比較，AR 模型組鼻黏膜組織中類胰蛋白酶表達水平顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與AR 模型組比較，玉屏風散組鼻黏膜組織中類胰蛋白酶表達水平則顯著降低（P＜0.05）。見表4，圖2。

圖2 各組小鼠鼻黏膜組織中類胰蛋白酶免疫組化染色（×200）

3.5 玉屏風散對AR 模型小鼠骨髓細胞表達CD117和FcεRI 的影響 各組小鼠骨髓細胞經流式細胞儀檢測發現，與正常對照組比較，AR 組小鼠骨髓CD117和FcεRI 雙陽性細胞比例明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與AR 模型組比較，玉屏風散組小鼠骨髓中CD117 和FcεRI 雙陽性細胞比例則顯著降低（P＜0.05）。見表5，圖3。

圖3 流式細胞儀檢測各組小鼠骨髓細胞中CD117 和FcεRI 雙陽性細胞比例

表5 各組小鼠骨髓細胞CD117 和FcεRI 雙陽性細胞比例比較（%，）

表5 各組小鼠骨髓細胞CD117 和FcεRI 雙陽性細胞比例比較（%，）

注：正常對照組及AR 模型組給予等量生理鹽水灌胃；玉屏風散組給予玉屏風散水煎劑（25g·kg-1·d-1）灌胃；AR 為變態性鼻炎；CD117 為特異性受體；FcεRI 為肥大細胞-IgE-高親和力受體；與正常對照組比較，aP＜0.05；與AR 模型組比較，bP＜0.05

4 討論

AR 是以特應性個體接觸致敏原后經IgE 介導的肥大細胞脫顆粒為開端的，多種免疫細胞和細胞因子參與的鼻黏膜Ⅰ型變態反應，肥大細胞源自CD34+骨髓前體細胞，干細胞因子能與特異性受體（CD117）結合，使上述前體細胞分化為肥大細胞。特應性個體吸入變應原，經氣道黏膜中的抗原提呈細胞識別，提呈給T 淋巴細胞，促使Th0 向Th2 轉換，Th2 通過分泌IL-4、IL-5、IL-13 等炎性因子，促進氣道變應性炎癥的發生、發展，并誘導變應原特異性B細胞增殖、分化以及合成特異性IgE，與聚集在鼻黏膜組織中成熟肥大細胞表面FcεRI 相結合[7-8]。當機體再次接觸相同變應原時，變應原與錨定在肥大細胞表面的IgE 分子交聯，活化肥大細胞，導致組胺等預貯存在肥大細胞顆粒物中的炎性介質釋放，引起速發相反應；肥大細胞還能分泌白三烯等細胞炎性因子，誘導血管內皮細胞、上皮細胞等分泌黏附分子、趨化因子及細胞因子等，募集和活化嗜酸粒細胞及Th2 細胞等免疫細胞，參與遲發相反應[2，9-10]。因此，肥大細胞作為AR 的重要效應細胞，調控其分化、成熟及活化過程，對于抑制AR 速發相和遲發相反應具有重要價值。

AR 歸屬中醫“鼻鼽”范疇。中醫認為，AR 患者的臨床發病往往屬于虛證，其中肺氣虛型患者最為常見。玉屏風散組方中的黃芪能滋補肺脾之氣，固表止汗；白術益氣健脾，防風祛風御邪，全方共奏益氣實衛之功效[11]。研究表明，玉屏風能優化機體內T 淋巴細胞亞群分布比例，繼而調節細胞免疫和體液免疫的功能，已廣泛用于AR、支氣管哮喘、呼吸道感染性疾病以及慢性阻塞性肺疾病[3，12]。玉屏風散能使AR大鼠鼻黏膜嗜酸性粒細胞趨化因子和調節激活正常T 細胞表達和分泌因子表達降低，減少AR 大鼠鼻黏膜中嗜酸性粒細胞的浸潤，從而減輕鼻黏膜的變應性炎癥[13]。

肥大細胞脫顆粒是肥大細胞區別于其他細胞的一種特異性功能狀態，為Ⅰ型變態反應中肥大細胞活化的重要標志。組胺、類胰蛋白酶、β 己糖胺酶常被用作定量測定肥大細胞脫顆粒水平的生物標志物[14-15]。CD117 和FcεRI 的表達水平可以用來分析肥大細胞的成熟度和純度[16-17]。本研究結果顯示，玉屏風散可明顯改善AR 模型小鼠的鼻部癥狀，減輕其鼻黏膜組織肥大細胞浸潤，降低鼻黏膜組織中類胰蛋白酶表達、血漿組胺和IL-13 水平，以及骨髓細胞CD117 和FcεRI 雙陽細胞的比例等提示肥大細胞成熟和活化的指標。因此，我們認為，玉屏風散不僅能抑制肥大細胞的分化、成熟及組織浸潤，也能通過降低肥大細胞脫顆粒及炎性因子分泌水平達到抑制肥大細胞活化的目的，從而改善AR 的鼻部癥狀。但其具體機制及相關信號通路尚不明確，有待細胞實驗及進一步動物實驗驗證。

綜上所述，玉屏風散對AR 具有良好的治療作用，其作用機制可能與調控肥大細胞的分化、成熟以及脫顆粒和分泌細胞因子水平有關。