基于液質聯用技術的高脂血癥金黃地鼠肝臟非靶標代謝組學研究

孫明謙，尹春園，苗 蘭，張 穎，劉建勛，楊會珍，林 力

（中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京100091）

代謝組學是一種系統生物學的方法，可以快速、全面地分析生物樣品中的小分子代謝物，揭示生命系統對任何環境或基因刺激的代謝反應，并可用于疾病的生物標志物發現。尤其對于代謝性疾病，如糖尿病［3－5］或動脈粥樣硬化［6－7］，代謝組學可以提供更多有關代謝過程和機制的進一步信息，因此近年來在高脂血癥的研究中取得了廣泛應用，在對疾病機制、藥物療效與作用機理的研究中取得了良好的進展。從臨床的診斷分型，到動物模型的建立與評價，均可利用代謝組學對高脂血癥異常的代謝途徑和發病機理進行探討，如近年來備受關注的氧化三甲胺（TAMO）就是通過代謝組學結合腸代菌研究發現的心血管疾病的重要生物標志物［8］。同時還有一些生物標志物通過代謝組學被發現（如短鏈脂肪酸、次級膽酸等），極大提高了人們對心血管疾病發病機理的認識［9］。

由于尿液和血漿等生物流體不能提供有關代謝變化的空間信息，近年來對組織代謝組學的研究越來越受到重視［10－11］，它能為損傷組織提供直接而豐富的信息，在機理探索和生物標志物發現中具有重要作用。本文采用反相色譜（RPLC）和親水作用色譜（HILIC）分離法對早期高脂血癥金黃地鼠肝臟進行了代謝組學研究。HILIC可作為RPLC分析極性組分的補充分離方法，而極性組分在組織勻漿中所占比例較高。本研究旨在通過兩種分離模式尋找更多潛在的生物標志物，為了解肝臟高脂血癥的病理學提供更多有用的信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 series超高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配備二元泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、PDA檢測器以及在線分析軟件等；Agilent 6520 series Q－TOF質譜儀（美國Agilent公司）；22 R高速離心機（德國Mikro公司），LAbOSPEC T003日立全自動生化儀（日本Hitachi公司）。

乙腈、甲醇（HPLC級，美國Fisher Scientific公司）；甲酸（99%，荷蘭J.T.Baker公司）。實驗用水為蒸餾水（中國娃哈哈公司）。次黃嘌呤、黃嘌呤、哌啶酸、尼克酰胺標準品（美國Sigma公司）。神經鞘氨醇、二氫神經鞘氨醇（加拿大Toronto Research Chemicals Inc.）。甘油磷酸膽堿、精氨酸（北京J&K Scientific公司）。總膽固醇（TG）、總甘油三酯（TC）、低密度脂蛋白（LDL－C）及高密度脂蛋白（HDLC）測定試劑盒（日本日立高新技術公司）。

1.2 動物實驗與樣品采集

SPF級7周齡敘利亞雄性金黃地鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號為SCXK（京）2016－0011。金黃地鼠在標準實驗室條件下（溫度：22℃；12 h光－暗循環）自由飲用無菌食物和自來水。一周后，隨機分為正常對照組（n=9）和高脂血癥模型組（n=9）。高脂血癥模型組飼喂高脂飼料6周，對照組飼喂正常飼料。實驗結束時，所有金黃地鼠均禁食12 h，取肝臟用生理鹽水沖洗，立即注入液氮，并儲存于－80℃下進行后續研究。

1.3 樣本處理

冷凍肝臟標本于室溫下解凍，在50%甲醇中以1∶10（w/v）的組織/溶液比均勻化。在使用均質器（德國IKA）的冰浴中，每均質10 s后，均化暫停10 s，重復均化2次直至獲得均勻的勻漿［12－13］。每個樣品均化后，均化器探針依次用水、甲醇和水清洗。然后在40 μL勻漿中加入200 μL的冷有機溶液（乙腈∶甲醇=1∶1），劇烈搖動20 s，室溫下保存10 min，在4℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液待分析［12－13］。

1.4 色譜條件

色譜分離在RP柱（BEH，C18，1.7 μm×2.1 mm×100 mm，Waters，Ireland）和HILIC柱（BEH，Amide，1.7 μm×2.1 mm×100 mm，Waters，Ireland）上進行。RP分析的流動相：A相為含0.1%甲酸的乙腈－水（1∶9）溶液，B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度程序如下：0～10 min，30%～80%B；10～12 min，80%B；12～14min，80%～30%B；14min，結束。兩針樣品之間的平衡時間為2min，流速為0.3mL/min，柱溫為35℃，進樣量為5μL。

HILIC分析的流動相：A相為含0.1%甲酸的水溶液，B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度程序如下：0～10 min，95%～80%B；10～13 min，80%～70%B；13～14 min，70%B；14～16 min，70%～95%B；16 min，結束。兩針樣品之間的平衡時間為2 min，流速為0.3 mL/min，柱溫為35℃，進樣量為5 μL。

1.5 質譜條件

Agilent 6250四極桿飛行時間質譜儀，離子源為雙ESI噴霧。霧化氣和干燥氣均為氮氣，碰撞氣為氦氣。采集模式為正離子模式，毛細管電壓為3 500 V，霧化溫度為350℃，干燥氣為10.0 L/min，霧化氣為206.85 kPa。質譜掃描范圍為m/z80～1 000，數據儲存模式為centroid。質譜采集數據通過2個已知的標準品［六（1H，1H，3H-全氟丙氧基）磷氮和7H-嘌呤，對應m/z分別為922.009 80和121.050 9］進行實時校正。參比液通過Agilent isocratic泵以0.01 mL/min的速度噴入質譜。Auto MS/MS實驗采用碰撞誘導解離（CID）碰撞的方式。

現行海島垃圾外運處理成本高，海路運至珠海費用高達2 000元/t，鎮政府每年支付壓縮類垃圾的運費就要花費約190萬元。就地焚燒，焚燒尾氣排放不達標，污染海島環境；生活垃圾經簡單分類投入焚燒爐中，未經干燥的垃圾含水率高，燃燒過程不穩定，燃燒溫度低；當燃燒溫度低于800℃，煙氣在氧氣、烯烴、氯條件下易于產生二惡英等劇毒物質［12］。焚燒站刺鼻的煙氣隨海風傳播，擴散半徑可達500 m，常年在垃圾站的工作人員和附近居民的健康都會受到影響。

1.6 數據處理

通過Agilent Mass Hunter（version 2.0）和Mass Professor profiler（MPP）B2.0軟件進行數據分析。在分子特征提取分析中，m/z的豐度數值大于500的數據被采集納入分子特征的計算中。豐度的計算由Mass Hunter 2.0軟件對每個分子相應的同位素和加合離子峰豐度加合后產生。最后，在采集的分子特征中，豐度大于3 000的分子特征被納入和整理成數據以待進一步分析。

通過Mass Hunter 2.0軟件產生的數據，進一步輸入到MPP B2.0軟件中進行分析。MPP B2.0分別采用排列、歸一化、數據集分割和數據縮放等方法對數據集進行預處理［14］。質量聚類窗口為10 ppm，保留時間聚類窗口為0.1 min。上述數據按照80%規則進行處理，僅保留任何組中至少80%的變量用于分析。豐度值經中位數歸一化及對數基二次變換后作為多變量分析的輸入數據分析。所得數據最后應用SIMICAP+12.0統計軟件進行偏最小二乘法判別分析（PLS－DA）。

2 結果與討論

2.1 高脂血癥金黃地鼠的血脂水平

造模6周后，不同組金黃地鼠血清的TG、TC、LDL－C、HDL－C濃度見表1。與正常對照組相比，模型組的TG、TC、LDL－C、HDL－C濃度明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.000 1），說明高脂血癥模型造模成功。

表1 金黃地鼠血清中TG、TC、LDL－C和HDL－C的濃度（xˉ±s，n=9）Table 1 Concentrations of TG，TC，LDL－C and HDL－C in serum of two groups hamsters（xˉ±s，n=9）

2.2 RPLC－MS與HILIC－MS分析

采用RPLC和HILIC結合飛行時間質譜（TOF MS）對高脂血癥和正常金黃地鼠的肝勻漿液進行代謝組學研究。HIILC對極性化合物的分離優勢已成為常規RPLC分離方法的重要補充。本研究采用HILIC模式測定872個特征變量，采用RPLC模式測定713個特征變量。在HPLC－TOF MS分析過程中，每進樣分析6個樣品后進1個質控（QC）樣品，所有樣品均取20 μL，混合成為均一的QC樣品。在每種電離模式下選擇6種代表性的離子評價分析方法的偏差，保留時間的相對標準偏差（RSD）小于1.0%，離子強度的RSD小于15%。結果表明，該方法是合理穩定的，數據可用于進一步的統計分析。

2.3 模式識別分析

采用PLS－DA對正常對照組和模型組肝勻漿中的代謝物譜進行分析，得到相應的散點分布圖（如圖1）。在RPLC模式下，PLS－DA結果（圖1A）顯示兩組間有明顯的分離，建模所用的主成分對原始數據的解釋度R2Y=0.999，模型的可預測度Q2=0.966。在HILIC模式下，PLS－DA結果（圖1B）顯示模型組與對照組呈現明顯的區別，PLS－DA參數如下：R2Y=0.988，Q2=0.940。HILIC和RPLC兩種模式的數據均表明，高脂血癥組的肝臟內源性代謝產物與對照組有顯著差異。

圖1 基于RPLC－MS（A）和HILIC－MS（B）數據的PLS-DA模式識別圖Fig.1 PLS－DA score plots based on data from RPLC－MS（A）and HILIC－MS（B）modes blue：control group；red：hyperlipidemic group

2.4 潛在生物標志物鑒定

VIP值（Variable importance for the projection）反映了每個變量（代謝物）對分類的影響，在PLS－DA處理后生成。從student′s t-test檢驗中篩選出VIP＞1、P＜0.05的潛在生物標志物進行進一步研究。首先利用這些特征的準確質譜和質譜同位素圖譜搜索數據庫METLIN（MPP中的輔助軟件包）。然后在MS/MS實驗的基礎上，對這些候選生物標志物的碎片離子進行分析或與數據庫進行比較［14］。其中，7種代謝物通過與標準化合物的比較得到了明確歸屬，但有些化合物特別是磷脂酰膽堿（PCs）仍需結合裂解途徑分析。如圖2，以PC（16∶0/18∶2）和PC（O－16∶0/2∶0）為例，闡明潛在生物標志物的鑒定。PC（16∶0/18∶2）的主要碎片離子m/z184代表磷膽堿離子，m/z86代表乙基三甲胺離子。PC（O－16∶0/2∶0）也具有m/z86離子的特征，但另一個離子m/z341是由磷膽堿離子的丟失形成。這些特征離子能區分PC和PE，而PE是一種主要的異構體，在裂解過程中性損失為m/z141。另一種碎片離子來自磷酸乙烯基。由于環氧樹脂的結構，很容易與鈉離子或鉀離子結合形成加合離子m/z147和m/z163。最后，對16個潛在的生物標志物進行不同置信度的鑒定。潛在生物標志物見表2。

表2 金黃地鼠肝臟代謝差異代謝物Table 2 Differential metabolites in hamsters liver

圖2 PC（16∶0/18∶2）（A）與PC（O-16∶0/2∶0）（B）的裂解分析Fig.2 MS/MS spectra and fragmentation analysis of PC（16∶0/18∶2）（A）and PC（O-16∶0/2∶0）（B）

2.5 生物功能分析

本研究表明，基于RPLC－MS和HILIC－MS技術的肝臟代謝組學可用于區分高脂血癥金黃地鼠和對照組。在高脂血癥金黃地鼠體內發現了16個具有顯著變化的潛在生物標志物（見表2）。在這些內源性代謝產物中，模型組的次黃嘌呤和黃嘌呤呈明顯下降趨勢。在嘌呤代謝中，次黃嘌呤可被黃嘌呤氧化酶（XO）氧化為黃嘌呤，再進一步被氧化為尿酸，導致高脂血癥金黃地鼠嘌呤代謝紊亂［15－16］。次黃嘌呤和黃嘌呤的降低可能表明黃嘌呤氧化酶活性上調，高活性XO可增加肝臟活性氧（ROS）自由基。ROS可能與多種生物分子發生反應，包括脂質、碳水化合物、蛋白質、核酸和結締組織大分子，從而干擾細胞功能［17］。一項關于金黃地鼠肝臟蛋白質組學的研究也報道了XO在高脂肪飲食下的表達上調［18］。

5種PCs在高脂血癥金黃地鼠體內呈上升趨勢，提示金黃地鼠脂質代謝紊亂。PCs在脂質吸收和轉運、細胞信號轉導和脂蛋白合成等方面發揮著重要作用。肝臟是PCs合成和血漿脂蛋白生成的主要場所［19］。PCs對極低密度脂蛋白的合成至關重要，高水平的肝PCs可促進極低密度脂蛋白向血漿輸出［20］。因此，PCs的增加最終導致金黃地鼠血漿中總甘油三酯和膽固醇的含量升高［17］。此外，模型組的甘油磷酸膽堿呈下降趨勢，它是PCs分解代謝的代謝物［21］。這也是磷脂代謝異常的另一個證據，表明PCs的下游代謝產物也受到影響。

鞘脂是生物膜中的主要類脂，也是細胞信號傳遞中的生物活性脂質介質［22］。高脂血癥組的神經鞘氨醇和二氫神經鞘氨醇呈升高趨勢，提示鞘脂代謝紊亂。鞘脂的增加可能減少膽固醇逆向轉運途徑，這可能是高脂血癥相關疾病中脂質紊亂的原因之一［23］。鞘脂還可通過鞘磷脂酶（Smase）代謝為神經酰胺，在高脂血癥的炎癥反應中起重要作用［24］。

高脂血癥組金黃地鼠的賴氨酸分解代謝產物酵母氨酸和哌啶酸的含量均發生顯著變化，說明高脂血癥組金黃地鼠的賴氨酸代謝紊亂。賴氨酸經賴氨酸－酮戊二酸還原酶代謝產生酵母氨酸，酵母氨酸的增加可能預示著賴氨酸的減少。據報道，高脂血癥組的游離賴氨酸水平較低可能提示高脂血癥發病機制中氧化應激的發生，從而加重脂肪肝和脂肪堆積［25］。高脂血癥組的精氨酸含量高。精氨酸是一種必需氨基酸，在心血管生理和病理生理中起著重要作用。它是一氧化氮合成的底物，在維持正常血管功能、降低血小板活性和白細胞粘附方面發揮重要作用［26－27］。在高脂血癥狀態下，對合成NO的需求增加，導致肝臟精氨酸含量增加。然而，精氨酸參與了許多代謝途徑，其作用機制有待進一步研究。高脂血癥組金黃地鼠體內異常的代謝途徑（包括嘌呤代謝、賴氨酸代謝、鞘脂代謝和磷脂酰膽堿代謝）歸納見圖3。

圖3 高脂血癥相關的生物代謝通路Fig.3 The disrupted metabolic pathway in hyperlipidemic hamsters

3 結論

本研究采用HILIC和RPLC色譜法結合TOF MS對高脂血癥金黃地鼠肝臟代謝進行了分析。在MS/MS實驗的基礎上，通過與相應標準的比較，確定了16個潛在的生物標志物。結果顯示，高脂血癥金黃地鼠肝臟的嘌呤代謝、賴氨酸代謝、鞘脂代謝和磷脂酰膽堿代謝紊亂。研究結果表明，基于RPLCMS和HILIC－MS的代謝組學策略是尋找肝組織潛在生物標記物的有價值的工具。