磁性分子印跡電化學傳感法檢測痕量奧卡西平

張 迪，李強翔，王志梅，廖力夫，肖錫林，3*

（1.南華大學 化學化工學院，湖南省天然錒系元素配合物設計與應用重點實驗室，湖南 衡陽421001；2.寧夏醫科大學附屬自治區人民醫院，寧夏 銀川750001；3.湖南大學化學/生物傳感與化學計量學國家重點實驗室，湖南 長沙410082）

奧卡西平（OXC）是一種可用于局部和全身性癲癇發作治療的神經性藥物，是卡馬西平的結構類似物，其副作用比卡馬西平小，在臨床實踐中得到普遍應用。但是，過量使用OXC的患者可能會出現頭暈、頭痛、皮疹和協調障礙等癥狀［1－3］。因此，檢測體內的OXC血藥濃度具有重要價值［4］?，F有多種檢測OXC的方法，包括分光光度法［5］、表面增強拉曼光譜法（SERS）［6］、液相色譜－質譜/質譜法（LC－MS/MS）［7］、高效液相色譜法（HPLC）、熱重分析法［8］、滴定法［9］、薄層色譜法（HPTLC）［10］等，但這些檢測方法通常操作復雜，成本較高。電化學傳感器因制備簡單、價格低廉、靈敏度高［11］等特點而被廣泛應用于分析檢測?；诖颂攸c，本文創建了一種高靈敏檢測樣品中OXC的電化學傳感器。

不同于分子探針及分子傳感器，分子印跡傳感器是一種在外層固體基質表面上分布印跡識別位點的器件［12－13］。磁性納米顆粒（NPs），尤其是Fe3O4＠SiO2磁性納米顆粒（MNPs），由于其順磁特性和獨特的物理化學特性而被應用于許多領域，例如分離、固相萃取、電化學等［14－15］。在應用中，由Fe3O4＠SiO2磁性納米顆粒制備的磁性分子印跡膜可在磁場下快速分離［16］。此外，經二氧化硅包裹的Fe3O4不僅可防止氧化和結塊，而且可以大大暴露出電極表面的活性位點，使靶標嵌入的可能性降低，從而為進一步功能化結構修飾提供了可能［14］。

該文中，計算機通過模擬并計算功能單體與不同模板分子的結合能（ΔE），篩選出合適的功能單體組合。在MNPs存在下，由模板分子（OXC）與篩選的功能單體組合（4－VP和MAA）在引發劑的作用下通過自由基交聯聚合得到聚合物（OXC/MNPs－MIP），隨后將經洗脫處理后的聚合物用于制備電化學傳感器MNPs－MIP/MCPE，并用于OXC的檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

奧卡西平（OXC）購自本地三甲醫院；4-乙烯基吡啶（4－VP）、甲基丙烯酸酯（MAA）、原硅酸四乙酯（TEOS）、2，2′-偶氮雙（2-甲基丙腈）（AIBN）、甲酸（MeCOOH）、乙醇（EtOH）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA，阿拉丁試劑有限公司）。以上試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水，所有實驗均在室溫下進行。

CHI660C電化學工作站（上海晨華儀器有限公司），Agilent 1100高效液相色譜（HPLC，4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷倫科技公司），Tecnai G2 F20透射電子顯微鏡（美國FEI公司）。

1.2 分子印跡聚合物的模擬

基于計算機Gaussian 09程序，在DFT/B3LYP/6－31+G基組條件下，優化出功能單體與OXC的最佳組合形式，計算出功能單體和OXC的ΔE和溶劑化能（ΔE*）。

1.3 MNPs－MIP/MCPE的制備

1.3.1 Fe3O4＠SiO2（MNPs）的制備根據參考文獻制備Fe3O4［17］：將1.35 g FeCl3·6H2O和3.6 g NaAc在40 mL乙二醇溶液中超聲30 min，攪拌直至完全溶解，將該混合物在N2下除空氣10 min后轉移至聚四氟乙烯高壓釜中，于200℃加熱8 h得到Fe3O4磁性納米顆粒，產品分別用乙醇和水洗滌多次，然后在真空干燥箱于60℃下真空干燥12 h。

采用凝膠－溶膠法制備Fe3O4＠SiO2［18］：將0.800 g Fe3O4分散在無水乙醇－水（體積比為4∶1）溶液中，超聲30 min。然后將5 mL氨水和5 mL TEOS逐滴加入上述溶液中，室溫下攪拌6 h，反應結束后在磁鐵的作用下用水和無水乙醇洗滌數次后分離出產物，置于60℃真空干燥8 h后，得到具有核殼結構的Fe3O4＠SiO2磁性納米粒子。

1.3.2 磁性分子聚合物（MNPs－MIP）的制備根據參考文獻［19］，在含有40 mL乙醇的燒杯中溶解1 mmol OXC和2 mmol MAA，攪拌反應2 h，再加入1 mmol 4－VP，攪拌反應1 h。然后加入0.05 g Fe3O4＠SiO2、4 mmol EGDMA（交聯劑）和60 mg AIBN（引發劑），氮氣置換除氧密封，超聲60 min，40℃下反應12 h得到OXC/MNPs－MIP。最后，將制備的物質置于乙酸－甲醇（體積比為3∶7）洗脫液中洗脫60 min，獲得MNPs－MIP并用水洗滌數次，在60℃真空干燥8 h，即得MNPs－MIP。

1.3.3 磁性碳糊電極的組裝稱取4 g石墨粉，1 mL石蠟油在燒杯中混合并攪拌至糊狀物，取適量糊狀物緊壓入長度約為8 cm內徑為4 mm的聚丙烯塑料管中，管的末端插長約5 cm的鉛筆芯作為電路連接點，另一端約1.5 mm處嵌入一塊圓形銣鐵硼磁鐵（直徑4 mm，厚為2 mm），再填充石墨粉包覆后打磨光滑，即制得磁性碳糊電極（MCPE）［20］。

將1.0 mg MNPs－MIP超聲分散在1 mL乙醇中，取其分散均勻的25 μL懸浮液均勻滴加到MCPE表面，得到MNPs－MIP/MCPE傳感器（如圖1A）。圖1B表示分子印跡聚合物的洗脫－重新結合機制，其中，分子印跡聚合物的洗脫和重結合是模板分子與功能單體混合后在氫鍵作用下形成的。作為對比，本文通過類似的操作制備了裸電極（MCPE），表面僅裝有MIP的磁性石墨電極（MIP/MCPE）及不加OXC制備的非分子磁性印跡聚合物MNPs－NMIP/MCPE。

圖1 MNPs－MIP/MCPE傳感器的設計和識別示意圖（A），及分子印跡聚合物的洗脫－重新結合機制（B）Fig.1 The schematic diagram for design and identification of the MNPs－MIP/MCPE sensors（A）and elution－rebinding mechanism of molecularly imprinted polymers（B）

1.4 電化學檢測

經修飾的MCPE與鉑電極和甘汞電極組成三電極系統，通過電化學工作站檢測OXC。將工作電極MCPE在OXC標準溶液中重新混合15 min，電極置于5 mL PBS緩沖液（pH 7.2）中進行檢測。實驗在DPV的最佳參數下進行：電勢從－1.5 V到－0.8 V，脈沖幅度為50 mV，掃描速率為30 mV/s，脈沖寬度為170 ms，電勢增量為20 mV。

1.5 實際樣品的制備

奧卡西平片（300 mg/片）、奧卡西平口服混懸液（60 mg/mL）在當地三甲醫院獲得。將一片用研缽粉碎的片劑溶于30 mL乙醇或5 mL口服混懸液加至25 mL乙醇。通過0.22 μm過濾器過濾后，將濾液轉移至50 mL容量瓶中，并用乙醇稀釋至刻度。然后，將100 μL該溶液加至5.0 mL PBS（pH 7.2）中，用作測試溶液。

收集志愿者服用300 mg OXC 3 h后的尿液樣本。在每次檢測前，將2 mL尿液與2.0 mL甲醇混合，10 000 r/min離心15 min以去除蛋白質。然后將上清液用PBS（pH 7.2）稀釋至5.0 mL，以降低基底效應，隨后用于分析。

2 結果與討論

2.1 分子優化

由于功能單體和溶劑的選擇影響MIP印跡位點的形成和識別性能［21－23］，且多種功能單體制備的MIP比單一單體具有更好的選擇性［24］。根據密度泛函數理論（DFT/B3LYP/6－31+G法），實驗優化了模板分子OXC和不同功能單體的最優構型（圖2），隨后依據圖3所示分別將不同的功能單體與模板分子結合計算其結合能ΔE，計算公式為：ΔE=ECET－ΣEM，式中，ΔE為聚合物的結合能，EC為聚合物的總能量，ET為OXC的能量，ΣEM為游離功能單體的能量之和。ΔE越小表示其結合能力越強，從表1（1～6）中不同組合構型的ΔE中得出以4－VP和MAA作為功能單體時，制備的印跡聚合物效果最佳。因此，實驗選擇OXC－（4－VP）－MAA為最佳體系。究其原因，可能是因為4－VP中的N可與OXC的羰基氧形成氫鍵，同時，4－VP的吡啶環與OXC的苯環可形成“π－π堆積”，從而大大提高了MIP結構的穩定性。而MAA不僅是質子供體，還是質子受體，可通過與OXC形成氫鍵和離子鍵以增強MIP結構的穩定性［19，25］。

表1 模板分子（OXC）與各不同功能單體復合物的結合能（ΔE）Table 1 The binding energy（ΔE）of different template molecule（OXC）－functional monomer complexes

圖2 功能單體及模板分子OXC的結構優化圖Fig.2 Structure optimization diagrams of functional monomers and the template molecule OXC

圖3 模板分子OXC結合單功能單體的結構優化圖Fig.3 Structure optimization diagrams of the template molecule OXC combined with single functional monomer

隨后，根據OXC分子的靜電勢圖（見圖4）可得出處于兩個不同位置的羰基氧的電負性不同（a＝－0.461，b＝－0.530）。因此，探討了OXC與功能單體的結合位點和組分比（圖5，表1中7～10）。在聚合物制備過程中，首先在體系中添加MAA，其羧基氫與OXC的羰基形成氫鍵—O…H—O—CO，使OXC結構中a、b位置的羰基氧被占據，而后體系中加入4－VP，4－VP的氮與OXC的氨基結合形成—CO—NH2…N—。

圖4 模板分子OXC、功能單體（4－VP和MAA）的靜電勢圖Fig.4 The electrostatic diagrams of the template molecule OXC and functional monomers（4－VP and MAA）

圖5 功能單體（4－VP和MAA）以不同的組分比結合模板分子（OXC）的結構圖Fig.5 Structure diagrams of the template molecule OXC and functional monomers（4－VP and MAA）combined in different component ratios

此外，如表1（10）所示，在OXC+（4－VP）+MAA=1∶1∶2時，ΔE最小，表明此時聚合物相對最穩定。因此推斷模板分子OXC與功能單體4－VP和MAA的結合比可能為1∶1∶2。

此外，反應溶劑也是反應成功的關鍵因素，溶劑化能|ΔE*|越小，對功能單體與模板分子的結合越有利。|ΔE*|計算公式為：|ΔE*|=Es－Ev，式中，|ΔE*|為聚合物的溶劑化能，Es為聚合物在溶劑環境中的結合能，Ev為聚合物在真空環境中的結合能。選擇的溶劑不僅需對印跡分子具有好的溶解性，且不能參與OXC與功能單體之間的結合。在制備聚合物的過程中，溶劑與聚合物之間的作用力越弱，越有利于聚合物的制備。本文模擬了聚合物分別以苯、丙酮、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）和水作為溶劑的結合效果，測得聚合物的|ΔE*|分別為15.411、46.225、47.144、49.227、50.200，即|ΔE苯*|＜|ΔE丙酮*|＜|ΔE乙醇*|＜|ΔEDMSO*|＜|ΔEwater*|。但由于苯不溶解OXC，而丙酮毒性相對較大。因此，實驗最終選擇價格低廉，且能快速溶解OXC的乙醇作為溶劑。

2.2 Fe3O4納米顆粒磁性印跡聚合物的表征

分別考察了Fe3O4、MNPs和MNPs－MIP的TEM圖像（圖6A～C）。通過對3圖的比較，可看出Fe3O4被SiO2成功包裹，形成了Fe3O4－SiO2核－殼結構，且Fe3O4－SiO2核殼納米顆粒的尺寸較大，這可能是在包硅過程中Fe3O4納米顆粒出現團聚，從而出現了“多核”的Fe3O4－SiO2核殼納米顆粒。

圖6 Fe3O4（A）、MNPs（B）及MNPs－MIP（C）的TEM圖Fig.6 TEM images of Fe3O4（A），MNPs（B）and MNPs－MIP（C）

2.3 MNPs－MIP/MCPE傳感器的電化學表征

在80 μmol/L OXC溶液中，考察了MNPs－MIP/MCPE和MCPE的循環伏安（CV）圖（圖7）。結果顯示，對于MCPE，OXC的峰值電流很弱（曲線a）。對于MNPs－MIP/MCPE電極，可觀察到在－1.19 V處出現1個峰電流值更大的陰極峰（曲線b）。表明已制備出MNPs－MIP/MCPE傳感器，且MIP與OXC具有良好的配位作用。

圖7 MCPE（a）及MNPs－MIP/MCPE（b）在OXC溶液中的循環伏安圖Fig.7 CV curves of MCPE（a）and MNPs－MIP/MCPE in OXC solution

對于MNPs－MIP/MCPE電極在－1.19 V處的陰極峰，根據OXC的結構推斷，發生的反應機理可能如下：

用DPV法進一步探究經MNPs－MIP修飾的電極及不同干擾電極上OXC的峰電流信號。如圖8（a－e）所示，OXC/MNPs－MIP/MCPE上的－1.19 V處出現明顯的峰值電流（圖8a）。在OXC/MNPs－MIP/MCPE上洗脫后，電流值較低，表明OXC已基本洗脫（圖8d）。在80 μmol/L OXC溶液中重組后，研究MCPE（f）、MNPs－MIP/MCPE（b）、MIP/MCPE（c）和MNPs/MCPE（e）的電流信號強度。結果顯示，在MNPs－MIP/MCPE上顯示出較高的電流值（圖8b）。上述實驗進一步證明印跡孔對目標具有較高的識別能力，且相對于MCPE（圖8f）和MNPs/MCPE（圖8e），OXC在MNPs－MIP/MCPE的電勢值有正向偏移，可避免某些干擾物質的影響。

圖8 不同電極在PBS（pH 7.2）溶液中的DPV曲線Fig.8 DPV curves of different electrodes in PBS（pH 7.2）solution

采用電化學阻抗法進一步研究不同修飾電極在含有2.0 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的0.2 mol/L KCl中的電化學性能（圖9）。結果顯示，裸電極MCPE的阻抗最小（曲線a），曲線幾乎呈一直線，表明電極表面可能為擴散限制過程［26－27］。MNPs－MIP/MCPE的阻值相對較?。ㄇ€b）。將MNPs－MIP/MCPE浸 入80 μmol/L OXC溶液中15 min，Rct值增至824 Ω（曲線c），表明探針分子通過的某些通道被阻斷。OXC/MNPs－MIP/MCPE的阻抗為1487 Ω（曲線d），表明已成功構建了聚合物層。洗脫靶后，電荷轉移電阻（Rct）降至157 Ω，這是因為洗脫后分子在電極上留下了空穴，從而減小了阻值。MNPs－NMIP/MCPE（曲線e）的Rct值為2 764 Ω，表明由于電極表面無印跡孔，探針分子幾乎無法通過。

圖9 在含有2.0 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的0.2 mol/L KCl中不同電極的EIS圖Fig.9 EIS curves of different electrodes in 0.2 mol/L KCl containing 2.0 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6

2.4 實驗條件的優化

2.4.1 洗脫溶劑與洗脫時間的選擇洗脫液的選擇是實驗的關鍵因素。洗脫液的洗脫強度太大，會洗脫整個印跡；洗脫力度太小，則印跡空腔洗脫不完全。本文基于經修飾的MCPE與鉑電極和甘汞電極組成三電極系統的DPV法在PBS緩沖液中考察了洗脫劑種類與配比的影響。考察了甲醇－乙酸（9∶1、8∶2、7∶3）、甲醇、乙醇和十二烷基硫酸鈉（SDS）分別用作洗脫液時的響應信號。結果顯示，以甲醇－乙酸（7∶3）為洗脫溶劑時，實驗效果最佳。

由于重組時間過長易造成不必要的時間損失，時間過短則實驗效果將受到較大影響，本實驗在50.0 μmol/L OXC溶液中考察了MNPs－MIP/MCPE和MNPs/MCPE的重組時間。如圖10所 示，與MNPs/MCPE電 極 相 比，OXC在MNPs－MIP/MCPE表面上顯示出較高的電信號，表明印跡聚合物對模板分子有較為顯著的識別能力，且Fe3O4＠SiO2與分子印跡膜相互作用使該傳感器具有更高的選擇性。此外，MNPs－MIP/MCPE的峰值電流隨著時間的延長而增加，且該電流在15 min內幾乎飽和。為了保證實驗的重組反應時間和高效性，選擇15 min作為最佳重組時間。

圖10 MNPs/MCPE（a）和MNPs－MIP/MCPE（b）對OXC響應時間的優化Fig.10 Time optimization on the response of MNPs/MCPE（a）and MNPs－MIP/MCPE（b）

2.4.2 緩沖溶液pH值的選擇電解質的pH值也會對電極表面的峰電流（IP）與峰電壓（Ep）有較大的影響，進而影響傳感器的靈敏度。本實驗將MNPs－MIP/MCPE置于100 μmol/L OXC標準溶液中重結合后，選擇pH=4.0～8.5的PBS緩沖液進行考察（圖11）。圖中可以清楚地觀察到Ep隨著pH值的增加而線性遞減，線性方程為：Ep=－0.748 0－0.061 7 pH（r=0.999 6），斜率值近似為能斯特方程計算的理論值－0.059V/pH。說明OXC參與反應的質子數和電子數相等，且pH 7.2時峰電流最大。因此，本文選擇在pH 7.2的PBS緩沖液中檢測樣品中OXC的濃度。

圖11 PBS緩沖液的pH值對OXC的電勢（Ep）和峰電流（Ip）的影響Fig.11 Effect of pH value on potential（Ep）and peak current（Ip）of OXC in PBS buffer

2.5 MNPs－MIP/MCPE的性能研究

2.5.1 線性范圍與檢出限在上述最優條件下，采用MNPs－MIP/MCPE傳感器對不同濃度（5×10-8～1.5×10－4mol/L）OXC的DPV信號進行檢測。如圖12所示，傳感器的峰電流信號隨OXC濃度的增大而增大，且OXC分別在5×10－8～3×10－6mol/L和3×10－6～1.5×10－4mol/L濃度范圍內與其峰電流信號呈線性關系，其線性方程分別為：Ip（μA）=1.755+1.097c（μmol/L），相關系數（r）=0.999 7和Ip（μA）=0.131+5.177c（μmol/L），r=0.999 6。中間線性的中斷可能是由于OXC在第一線性范圍內亞單分子的形成以及在第二線性范圍內單分子的形成所致［28－29］。傳感器檢測OXC的 檢 出 限（LOD）為2.06×10－8mol/L（LOD=3S/m，其中S為校準曲線截距的標準偏差，m為校準曲線的斜率）。

圖12 MNPs－MIP/MCPE傳感器在不同濃度OXC中的DPV曲線Fig.12 DPV curves of MNPs－MIP/MCPE in different concentration of OXC concentration of OXC（a－h）：1.0，2.5，30.0，50.0，90.0，110.0，130.0，150.0 μmol/L

2.5.2 穩定性與選擇性分別在20、40、60 μmol/L OXC溶液中對同一MNPs－MIP/MCPE傳感器的峰電流進行5次分析，3種OXC濃度的RSD分別為4.8%、5.3%、5.0%。同一傳感器在存放30 d后，其電化學響應信號仍為初始值的95.3%。實驗結果表明該傳感器具有較好的重現性和穩定性。

此外，研究了傳感器對OXC的選擇性和其他干擾物質對檢測OXC的影響。結果表明，當OXC的濃度為1 μmol/L時，5倍濃度的類似結構藥物卡馬西平（CBZ）和拉莫三嗪（LMT）；200倍濃度的10倍濃度的尿酸（UA）、多巴胺（DA）、維生素（VC）；15倍濃度的蘇氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）、天冬氨酸（Asp），對OXC的檢測影響均在允許相對誤差（10%）以內。表明本文制備的MNPs－MIP/MCPE傳感器對OXC的檢測具有較高的選擇性。

2.6 實際樣品的分析

基于本方法檢測了片劑（300 mg/片）、口服混懸液（60 mg/mL）及尿液中的OXC含量［30］，以評估MNPs－MIP/MCPE傳感器的檢測性能，結果如表2所示。通過加標回收實驗考察了該方法的準確度，即向樣品中分別加入20、40、60 μmol/L的OXC，每一濃度樣品平行檢測3次，測得回收率為99.4%～101%，相對標準偏差（RSD）為1.5%～2.5%。實驗結果表明，該方法具有良好的精密度和準確度。進一步采用HPLC法進行驗證，實驗結果在置信度95%以上，表明該傳感器可用于實際樣品中OXC的檢測。

表2 MNPs－MIP/MCPE傳感器對片劑、口服混懸液和尿液中的OXC檢測結果（n=6）Table 2 Detection result of OXC in tablets，oral suspension and urine by MNPs－MIP/MCPE sensor（n=6）

將該方法與其他電化學檢測方法進行比較（如表3），可知本文建立的傳感器具有更低的檢出限和更寬的線性范圍，是一種成本更低、靈敏度更高的檢測工具。

表3 該方法與其他電化學方法測定OXC的對比Table 3 Comparison of this method with the other electrochemical methods for the determination of OXC

3 結論

本文合成了一種磁性印跡傳感器MNPs－MIP/MCPE用于檢測樣品中的OXC。實驗首先通過模擬計算篩選出最佳功能單體組合（4－VP和MAA）及反應溶劑，并基于磁性Fe3O4＠SiO2NPs為原料，合成了磁性印跡傳感器MNPs－MIP/MCPE。結果顯示，體系酸度為7.2的條件下，MNPs－MIP/MCPE傳感器具有出色的檢測OXC的性能，可實現對實際樣品中OXC的測定。該傳感器制備簡單、靈敏度高，可為其他檢測方法提供一定的理論基礎。