UHPLC－MS/MS法分析氯化乙酰甲膽堿霧化氣溶膠濃度

朱狄峰，趙劍嵐，洪雅雯，錢仁云，陳 超，平 麗

（浙江大學 藥學院 藥物安全評價研究中心，浙江 杭州310058）

吸入用氯化乙酰甲膽堿是一種供霧化的吸入用粉末制劑，屬于乙酰甲膽堿類藥物，其主要成分為氯化乙酰甲膽堿。氯化乙酰甲膽堿屬于M膽堿受體激動劑，對心血管系統作用較強，也可收縮支氣管平滑肌［1－3］。臨床上常用作支氣管激發試驗（MIC）檢測氣道高反應性的診斷試劑［4－5］。歐洲呼吸學會（ERS）在2017年更新了支氣管激發試驗技術標準［6］，該標準強調診斷試劑劑量而非濃度的重要性。但是，ERS在隨后的研究發現，僅考慮劑量會導致試驗存在許多問題和不確定性。作為特殊的給藥制劑，吸入給藥制劑是通過霧化后的氣溶膠進入呼吸道深處的肺部發揮局部或全身作用，因此，ERS建議關注診斷試劑實際霧化吸入的藥物濃度［7］。

目前，僅國外報道了氯化乙酰甲膽堿的多種檢測方法，包括比色法［8］、離子對液相色譜法［9］和毛細管電泳法［10－11］，但檢測濃度范圍均在50 μg/mL以上，不適用于低濃度的檢測，而霧化氣溶膠狀態下的濃度檢測方法尚無相關報道。乙酰甲膽堿類藥物的霧化氣溶膠濃度檢測存在挑戰，致使ERS指南推薦用沙丁胺醇水溶液代替該類藥物的檢測，以沙丁胺醇氣溶膠量外推乙酰甲膽堿氣溶膠的藥物濃度［7］。然而，此種替代方法帶來的弊端是顯而易見的，實際乙酰甲膽堿氣溶膠量仍未可知。超高效液相色譜－三重四極桿質譜法（UHPLC－MS/MS）是痕量物質檢測的常用方法［12－13］。本研究通過改良吸入暴露裝置，采用UHPLC－MS/MS法對吸入制劑給藥過程中霧化氣溶膠中的氯化乙酰甲膽堿進行檢測，可用于吸入用氯化乙酰甲膽堿氣溶膠的質量控制，也為藥物安全性評價和藥代藥效相關性（PK/PD）研究的供試品分析提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜－三重四極桿質譜聯用儀（ACQUITY UPLC I－CLASS+/Xevo TQ system，美國Waters公司）；JAC 4020超聲波清洗器（韓國KODO技術研究有限公司）；XS205十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；5810R離心機、Research plus移液器（德國Eppendorf公司）；Purelab Option S7超純水系統（英國ELGA LabWater公司）；PARI BOY N型壓縮霧化吸入機（德國百瑞公司）；YAN30012氣溶膠定量霧化注射針（上海玉研科學儀器有限公司）。

吸入用氯化乙酰甲膽堿（商品名：Provocholine，日本三和化工株式會社，規格：每支100 mg）；氯化乙酰甲膽堿對照品（東京化學工業有限公司，含量為100.6%，批號：HKLTH）；內標：酒石酸氫膽堿對照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量≥98%，批號：1108803）。氯化鈉注射液（杭州民生藥業有限公司，批號：C1808102）。乙腈（色譜純，德國Merck KGaA公司）；甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；其余試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液與供試品溶液的制備

精密稱定氯化乙酰甲膽堿對照品適量，用乙腈配制成100 μg/mL的儲備液；相同方法配制2.5 μg/mL的內標酒石酸氫膽堿標準溶液。精密吸取氯化乙酰甲膽堿儲備液和內標標準溶液適量，用乙腈稀釋成質量濃度分別為10、20、50、80、100 ng/mL的標準溶液（內標均為25 ng/mL），即得。

取吸入用氯化乙酰甲膽堿1支，加入氯化鈉注射液4.0 mL，振搖溶解配制成質量濃度為25 mg/mL的供試品溶液。

1.3 提取溶劑的制備

精密稱定酒石酸氫膽堿對照品適量，用乙腈稀釋成25 ng/mL的酒石酸氫膽堿溶液作為提取溶劑。

1.4 霧化氣溶膠樣品溶液的制備

取吸入用氯化乙酰甲膽堿供試品溶液，倒入壓縮霧化吸入機藥皿中，將出氣口連接至自制吸入暴露裝置上口（圖1），壓縮霧化吸入機的霧化速率為0.25 mL/min，霧化時間為3 min。經霧化機霧化后溶液會迅速形成氣溶膠。在室溫下霧化1 min后，從吸入暴露裝置上、中、下3個位置的中間導管口緩慢抽取含藥物的氣溶膠至50 mL注射器（內含3 mL提取溶劑）中，抽取后迅速用小膠塞封閉注射器，靜置5 min，振搖2 min，重復靜置振搖1次，移至離心管進行離心（離心力為8 000 g，離心時間為10 min），上清液作為供試品霧化氣溶膠樣品溶液。

圖1 吸入暴露裝置示意圖Fig.1 The schematic of inhalation exposure device

1.5 儀器條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫為40℃；以0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫，流速為0.3 mL/min；分析時間為5 min；進樣量為5 μL。梯度程序為：0.0～2.0 min，30%～50% B；2.0～3.1 min，50%～90% B；3.1～4.0 min，90% B；4.0～4.1 min，90%～30%B；4.1～5.0 min，30%B。

質譜條件：電噴霧離子源；毛細管電壓為2.00 kV；碰撞氣流速為0.15 mL/min；離子源溫度為150℃；脫溶劑和加熱塊溫度為500℃；脫溶劑氣體流速為800 L/h。采用多反應監測（MRM）正離子模式進行監測，總分析運行時間為5 min。錐孔電壓、碰撞能量、前體和產物離子等參數見表1。

表1 氯化乙酰甲膽堿及酒石酸氫膽堿的質譜參數Table 1 Mass spectrum parameters of methacholine chloride and choline bitartrate

2 結果與討論

2.1 檢測條件的優化

考察了水－乙腈、水－甲醇、0.1%甲酸水－乙腈、0.1%甲酸水－甲醇作為流動相對氯化乙酰甲膽堿和內標酒石酸氫膽堿的影響，結果顯示，以0.1%甲酸水－乙腈作為流動相時的分離效果較好，故選用該溶液作為流動相。考察了ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Agilent Extend－C18柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）和Agilent Eclipse XDB－C18柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）等不同色譜柱的分離效果，發現采用柱長過短、粒徑過大的色譜柱時待測藥物的保留時間較短，峰面積重復性較差，不利于藥物的洗脫分離。而采用ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）的保留時間和分離效果相對合適，因此選擇該柱為色譜分離柱。

氯化乙酰甲膽堿和酒石酸氫膽堿均為季銨堿類化合物，可離子化產生陽離子，因此選擇ESI正離子模式進行分析。通過分別注入500 ng/mL的氯化乙酰甲膽堿和內標溶液至質譜儀，使用儀器Intellistart自動調諧功能在MRM模式下對兩個化合物進行碎片離子分析，發現氯化乙酰甲膽堿和酒石酸氫膽堿具有2個特征子離子，其m/z分別為101.1、60.1和60.0、45.2，比較最終的響應值和穩定性，確定氯化乙酰甲膽堿和酒石酸氫膽堿的定量子離子分別為m/z101.1和m/z60.0，并獲得相應的錐孔電壓和碰撞能量。在“1.5”條件下，氯化乙酰甲膽堿和內標與其他干擾物質的分離度良好。圖2為優化后樣本檢測的MRM色譜圖。

圖2 霧化氣溶膠樣品溶液的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of aerosol sample

2.2 提取方法的選擇

分別比較了水、甲醇、50%甲醇水、50%乙腈水、乙腈作為供試品霧化后提取溶劑的效果，結果顯示，水、甲醇、50%甲醇水、50%乙腈水作提取溶劑時，氯化乙酰甲膽堿的峰形出現拖尾現象。乙腈作為提取溶劑時氯化乙酰甲膽堿的出峰較好，提取回收率超過95%，因此選擇乙腈為提取溶劑（圖3）。同時考察了不同注射器體積（10、20、50 mL）的影響，發現注射器體積為10 mL和20 mL時供試品霧化氣溶膠樣品溶液的濃度低于或接近定量下限，最終采用50 mL注射器。還對比了提取溶液體積（1、2、3、4、5 mL）的影響，結果顯示提取溶液體積為1 mL和2 mL時的提取回收率均低于90%，提取溶液體積為4 mL和5 mL時溶液的濃度相對較低，重復性低于3 mL時，因此最終采用3 mL作為提取溶液體積。

圖3 乙腈為提取溶劑時氯化乙酰甲膽堿的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of methacholine chloride with acetonitrile as the extraction solvent

2.3 霧化吸入條件的優化

目前，吸入制劑霧化濃度主要采用重量法檢測，通過不同濾膜吸附后質量的變化值進行計算［14－18］，該方法適用于粉末類制劑。而溶液類制劑會隨著濾膜吸附逐漸達到飽和，導致吸附效率遞減，檢測的濃度不能反映實際的霧化濃度。本研究自制了簡易吸入暴露裝置（見圖1），可直接抽取霧化氣溶膠進行檢測。其上部為進氣口，下部有調節出氣孔，自上而下每隔15 cm有導管連接至外部。

霧化吸入過程中，吸入暴露裝置結構、霧化速率和霧化時間是關鍵因素。考慮到裝置主要用于吸入毒性研究，為確保單組動物給藥可在一次吸入試驗完成，結合每個孔的合理間距，將其設計為高60 cm，直徑40 cm的密閉鋼質圓筒。同時，對進氣口和出氣口進行調試后確定孔徑大小為3 cm。吸入用氯化乙酰甲膽堿在臨床上的使用時間一般低于3 min，25 mg/mL供試品溶液使用的累積吸入劑量一般約為0.3 mg［19］。因此，霧化時間設計為3 min。根據最終的動物預期藥物吸入量進行優化后，確定霧化速率為0.25 mL/min，該速率下動物累積預期藥物吸入量可達到0.3 mg。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性取空白溶液、標準對照品溶液和供試品霧化氣溶膠樣品溶液（中間位置樣本），吸取5 μL進樣分析，其中樣品溶液的MRM色譜圖見圖2。氯化乙酰甲膽堿和內標酒石酸氫膽堿的保留時間分別為1.28、1.11 min，經計算得到兩成分的拖尾因子均不大于2.0，與各自相鄰峰的分離度均大于3.0。表明兩成分的分離度良好，無雜質干擾。

2.4.2 線性關系與定量下限精密量取標準溶液5 μL（質量濃度為10、20、50、80、100 ng/mL，內標均為25 ng/mL）進樣分析，得到色譜峰面積。以氯化乙酰甲膽堿的質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標，氯化乙酰甲膽堿和內標的峰面積比值（Y）為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，求得回歸方程。并以信噪比大于10時的最低線性濃度確定為定量下限（LOQ）。結果表明，氯化乙酰甲膽堿在10～100 ng/mL范圍內線性良好，標準曲線方程為Y=0.070 0X+0.030 1，r＞0.999，定量下限為10 ng/mL。

2.4.3 儀器精密度取20、50、80 ng/mL的氯化乙酰甲膽堿標準溶液（內標均為25 ng/mL）連續進樣6次，計算儀器精密度，其色譜峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為1.2%、1.0%和1.2%，結果表明儀器精密度良好。

2.4.4 加標回收率實驗取已知濃度的供試品霧化氣溶膠樣品溶液（中間位置樣本）各3份，加入一定量的標準溶液進樣測定，計算加標回收率為98.1%～100%，平均回收率為99.2%，平均RSD為0.80%（見表2）。

表2 加標回收率實驗結果（n=3）Table 2 Results of recovery tests（n=3）

2.4.5 提取回收率取氯化乙酰甲膽堿儲備液和內標溶液適量，用乙腈稀釋得到低、中、高質量濃度的樣品（氯化乙酰甲膽堿為20、50、80 ng/mL，內標為25 ng/mL），進樣分析得到色譜峰。用氣溶膠定量霧化注射針吸取10 μL標準溶液（氯化乙酰甲膽堿為6、15、24 μg/mL），霧化注入至50 mL注射器（內含3 mL提取溶劑）中，其他按霧化氣溶膠樣品處理，進樣分析得到色譜峰。計算兩者峰面積的比值得到提取回收率和RSD。結果表明，霧化氣溶膠的平均提取回收率為95.7%，RSD為1.8%。

2.4.6 穩定性實驗取質量濃度均為20、50、80 ng/mL的標準溶液、供試品溶液，以及該質量濃度下的供試品溶液經霧化1 min后得到的供試品霧化氣溶膠樣品溶液，分別放置0、4、8、12 h后進樣測定，考察氯化乙酰甲膽堿的穩定性。最終計算得到氯化乙酰甲膽堿濃度的RSD均低于1.5%，表明標準溶液、供試品溶液和供試品霧化氣溶膠樣品溶液均在12 h內穩定。

2.5 供試品霧化氣溶膠樣品的含量測定

供試品在吸入裝置中經霧化1 min后，測得其上、中、下位置的氯化乙酰甲膽堿氣溶膠樣品平均濃度分別為609.2、604.9、610.2 mg/m3，RSD為1.2%，上、中、下位置的氣溶膠濃度基本達到了均一穩定，氣溶膠的平均藥物濃度為608.1 mg/m3，表明可以用于吸入性評價實驗。在用于大鼠吸入研究實驗時，根據大鼠肺功能的通氣量正常參數值216.02 mL/min（76～517 mL/min）［20－21］，計算得到大鼠在吸入暴露裝置經霧化3 min后的累積吸入量約為0.39 mg（0.14～0.94 mg），該吸入量符合預期目的。

3 結論

本文通過比較不同的檢測條件和提取方法對霧化氣溶膠中氯化乙酰甲膽堿定量的影響，確定以0.1%甲酸水－乙腈為流動相，乙腈為提取溶劑，建立了定量檢測霧化氣溶膠中氯化乙酰甲膽堿的UHPLC－MS/MS方法。該法快速靈敏，精密度、穩定性和回收率均符合要求。通過設計簡易吸入霧化裝置，并優化霧化速率、霧化時間，將UHPLC－MS/MS方法成功應用于測定霧化裝置中的氯化乙酰甲膽堿氣溶膠濃度，發現氣溶膠在霧化裝置中霧化1 min后即達到均一穩定。該方法適用于吸入性藥物評價研究，也為吸入制劑霧化氣溶膠供試品分析和有效控制提供了科學依據。