125I粒子近距離照射腺樣囊性癌細胞的生物學效應

吳亞東 趙科 尹鑫海 黃光磊 林渡人 羅洪

(1貴州醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科，貴州 貴陽 550004；2貴州省人民醫院口腔頜面外科；3貴陽市第二人民醫院(金陽醫院)口腔科)

涎腺癌是口腔頜面頭頸部較為常見的上皮性癌，好發于腮腺、下頜下腺、舌下腺及口腔的小涎腺，也可見于鼻腔、咽部及淚腺等。涎腺癌的主要治療手段為擴大切除，但擴大切除往往需要犧牲面神經、舌神經、舌下神經等重要的解剖結構，導致面癱、舌麻木、舌運動障礙等嚴重的并發癥。即便如此，由于口腔頜面頭頸部的解剖限制，涎腺癌的擴大切除范圍往往存在不足，從而導致局部復發率較高。研究表明，術后放療可以降低涎腺癌患者術后局部復發率和提高患者生存率〔1〕。近年來，放射性125I粒子組織間植入近距離治療涎腺癌取得了令人滿意的療效〔2〕。但是查閱文獻沒有發現針對放射性125I粒子近距離治療涎腺癌生物效應和處方劑量的研究，在實際的臨床工作中，人們對于放射性125I粒子近距離治療涎腺癌的處方劑量存在較大差異，這會造成治療劑量不足或因超治療劑量導致影響療效及增加并發癥。美國放射學會(ACR)和美國近距離放療學會(ABS)根據大量的文獻回顧和系統評價，推薦125I粒子近距離治療前列腺癌的處方劑量是140～160 Gy〔3〕。本研究建立放射性125I粒子體外照射細胞模型，通過對比125I照射涎腺腺樣囊性癌ACC-2細胞和前列腺癌PC-3細胞的存活曲線和放射生物學參數，根據ABS推薦125I粒子近距離治療前列腺癌的處方劑量來推算出治療涎腺腺樣囊性癌的處方劑量，從而對臨床125I粒子近距離治療涎腺癌給予適當的處方劑量提供實驗數據支持。

1 材料和方法

1.1細胞系和試劑 分別取對數生長期人腺樣囊性癌ACC-2及人前列腺癌PC-3細胞系(美國模式培養物集存庫,ATCC)，用胰蛋白酶進行消化，1 000 r/min離心5 min后重懸，用血細胞計數板及臺盼藍染色計數活細胞濃度，梯度稀釋。然后將合適數量的細胞接種于細胞培養皿中，用含有10%胎牛血清(四季青公司)、青霉素100 U/ml的RPMI1640培養基(Gibco，美國)置于37℃，5%CO2的孵箱中培養。

1.2離體照射模型 離體照射模型參照英國GARY實驗室設計的粒子離體照射細胞研究系統〔4〕，2 mm厚聚甲丙烯酸甲酯板支架，分為上下兩層，上層為細胞培養板，下層為粒子盤。將8枚7611型125I粒子(江蘇華益生物公司)按等距離分布直徑3 cm的圓周上，圓心放置1枚粒子。125I粒子的活度為37 MBq(1 mCi)，111 MBq(3 mCi)，模型如圖1。根據蒙特卡洛建模模擬方法推算出在該離體照射模型下細胞分別受到2、4、6、8、10 Gy所需要的照射時間如表1。高劑量率分隔外照射組使用RS-2000Pro生物學X射線輻射儀(美國)，能量為250 KeV，劑量率為50 cGy/min。

(a)參照英國GARY實驗室設計的粒子離體照射細胞研究系統〔4〕；(b)放射性粒子分布〔4〕；(c)實驗中所使用的照射模型和放射屏蔽防護裝置圖1 放射性125I粒子持續低劑量率體外照射細胞模型

表1 放射性125I粒子照射時間

1.3細胞克隆形成實驗 將合適數量的細胞接種于細胞培養皿中，分別給予X線分割照射(X線組)和125I持續低劑量率照射(125I-CLDR組)：0、2、4、6、8和10 Gy劑量照射，每個劑量點設3個平行樣本。照射結束后繼續培養10～14 d，甲醇固定，瑞氏姬姆薩染色，蒸餾水漂洗1～2遍。常規顯微鏡下計數含50個細胞以上的克隆數，分別計算X線組與125I-CLDR組各劑量點的接種效率(PE)和細胞存活分數(SF)。PE=(克隆數/細胞接種數)×100%，SF=(克隆數/細胞接種數×PE)×100%。根據單擊多靶模型y=1-〔1-exp(-k×x)〕^N〔5〕，采用兩照射組2 Gy劑量點的細胞存活分數之比估算相對生物學效應RBE=SF2(X線)/SF2(125I)。

1.4統計方法 應用Graphpad prism7.0分別對結果按照單擊多靶模型y=1-〔1-exp(-k×x)〕^N，擬合細胞存活曲線，分別計算出各自的D0、N、Dq、D37和SF2。應用SPSS21.0軟件分別對ACC-2細胞125I組和X線組，PC-3細胞125I組不同劑量點的細胞克隆形成率進行重復測量的方差檢驗，對細胞存活曲線進行擬合優度檢驗。

2 結 果

2.1PC-3和ACC-2細胞受兩種射線照射后增殖能力 隨著時間和照射劑量的增加，PC-3細胞和ACC-2細胞的接種效率明顯下降。見圖2。不同劑量組總體均值間差異有統計學意義(P<0.05)；兩組PC-3細胞接種效率(除劑量10 Gy外)差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同射線及照射劑量下PC-3細胞和ACC-2細胞接種效率

2.2PC-3 和ACC-2 細胞分別受到不同劑量的125I粒子和X線照射后劑量存活率比較將兩種細胞的分別受到不同劑量和照射方式的細胞存活率進行劑量生存曲線分析，發現在隨著照射劑量的增大細胞存活率下降，至6 Gy時，細胞存活率急劇下降，至10 Gy時幾乎沒有細胞存活。在2 Gy和4 Gy劑量組，PC-3細胞受到X線分割照射的細胞存活率明顯高于125I-CLDR組(P<0.05)。見表3。根據單擊多靶模型，PC-3細胞和ACC-2細胞在分別接受X線和125I照射后的D0、N、Dq、D37、SF2各組間PC-3、ACC-2差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表3 PC-3和ACC-2細胞分別受到不同劑量的125 I粒子和X線照射后劑量存活率

表4 PC-3和ACC-2細胞受X線和125I照射后的放射生物學參數

2.3PC-3和ACC-2的相對生物效應(RBE) ACC-2受到放射性125I粒子持續低劑量率照射相對于250 KeV的X線分割照射的RBE為1.28，PC-3的RBE為1.07。

(a)ACC-2細胞受不同劑量放射性125I粒子持續低劑量率照射后的細胞克隆形成情況；(b)ACC-2細胞受不同劑量X線照射后的細胞克隆形成情況；(c)PC-3細胞受不同劑量放射性125I粒子持續低劑量率照射后的細胞克隆形成情況；(d)PC-3細胞受不同劑量X線照射后的細胞克隆形成情況圖2 PC-3和ACC-2細胞分別受到不同劑量的125I粒子和X線照射后細胞克隆形成情況

2.4ACC-2細胞受125I粒子照射處方劑量的推算 在PC-3和ACC-2細胞受到放射性125I粒子持續低劑量率照射的細胞生存曲線上，選取細胞存活分數為0.1(即被射線照射后細胞存活率為10%)的劑量點作為生物學參考點，ACC-2細胞所需的劑量為4.75 Gy，PC-3所需要的劑量為4.02 Gy，對兩組數據進行t檢驗，t=1.85，P=0.14，無統計學差異，由此可以間接推導出放射性125I粒子持續低劑量率照射腺樣囊性癌ACC-2細胞的處方劑量應該與照射前列腺癌PC-3細胞相當，為140～160 Gy。

3 討 論

腺樣囊性癌占口腔頜面部惡性腫瘤的15%～25%，占涎腺腫瘤的10%〔6〕，是舌下腺和小涎腺最常見的惡性腫瘤，除此之外，腺樣囊性癌也可發生在淚腺〔7〕、耵聹腺〔8〕、鼻腔鼻竇〔9〕、咽喉〔10〕、支氣管〔11〕等部位。腺樣囊性癌侵襲性強，早期極易侵犯神經和血管，其主要治療手段為手術根治配合術后放射治療，但是由于其侵襲性強及頭頸部解剖條件的限制，對于較大范圍的腺樣囊性癌很難做到完全根治，因此術后輔以放療十分有必要。Harrison等〔12〕研究對涎腺高度惡性病變的患者手術加放療組比單獨手術組5年生存率明顯提高，分別為57%和28%，局部控制率分別為63%和40%。Yu等〔13〕對405例涎腺癌分析結果表明，單獨分析腺樣囊性癌，單純手術者5年和10年生存率分別為56.6%及34.5%，而手術結合放療組其5年和10年生存率分別為93.3%和68%。因此，術后放療是降低腺樣囊性癌的復發率，提高患者的生存率的重要手段。但是傳統的外照射由于照射面積過大，對周圍正常組織的損傷不可避免，由此造成的放射性骨髓炎、皮炎、黏膜炎、器官功能減退等副作用使患者苦不堪言。放射性粒子植入要求靶區達到很高的根治腫瘤的處方劑量(PD),要求治療靶區的邊緣必須匹配達到PD，而周圍正常組織，受到較少的輻射損傷，因此放射性粒子植入治療本質上就是一種精確放療。從臨床實踐比較，放射性粒子植入治療具極好的適形性，靶區PD可能要高于外照射時的劑量，對腫瘤的局部控制療效更好。放射性125I是目前臨床應用最廣泛的放射性核素之一，其半衰期為59.4 d，在其衰變過程主要產生27 KeV、31 KeV的X射線和35 KeV的γ射線。1965年美國的Memorial Sloan-Kettering 癌癥中心率先對124例晚期頭頸部復發癌進行了125I粒子植入治療。隨后，這種放射性粒子被廣泛應用于前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌等各種類型腫瘤的治療〔14〕。國內外部分學者醫生使用這一技術治療涎腺癌，取得了良好的效果。Stannard等〔15〕對9例腭部小涎腺癌術后切緣陽性的患者加用125I粒子治療，隨訪時間32～158個月，獲得了100%的局部控制率。北京大學口腔醫院〔16～18〕用放射性125I粒子植入治療以涎腺癌為主的口腔頜面部惡性腫瘤，取得了良好的效果。本課題組團隊從2006年開始利用放射性125I粒子植入近距離治療以涎腺癌為主的頭頸部惡性腫瘤，到目前為止，取得了令人滿意的療效〔19,20〕。

本研究表明，放射生物學中細胞受電離輻射照射后，受照射細胞既可以呈現即刻死亡，也可能延遲一段時間后才表現出死亡，即增殖環節出現的細胞死亡，稱為細胞增殖性死亡。一般而言，細胞增殖性死亡是不能經MTT實驗、LDH漏出實驗或臺盼藍拒染法等加以檢測。放射生物學上，人們通常采用細胞克隆形成實驗來檢測電離輻射照射后，細胞在克隆性細胞增殖能力上的變化。顯而易見，細胞死亡的程度與細胞受照射劑量的大小直接相關，在放射生物學中細胞死亡程度更多采用細胞存活分數來表示。哺乳類細胞受照射后，單擊多靶數學模型能較好地說明這種細胞存活與受照劑量之間相關性的數學規律。因此我們采用單擊多靶數學模型對細胞存活分數與受照劑量各自之間的原始數據進行擬合，從而獲得細胞存活曲線的數學表達式及其一些重要的參數，如k、N、D0、Dq、SF2等。在單擊多靶細胞存活模型中，k為細胞存活曲線的鈍化常數，其值由擬合方程直接給出；N為外推數，理論上代表靶的數目，數值大小也是由擬合方程直接給出；D0為平均致死劑量，理論上D0是使每個細胞平均被擊中一次所需要的輻射劑量，數值上D0=1/k；Dq為準閾劑量，代表修復亞致死損傷的能力，Dq值反映了細胞抵抗電離輻射修復亞致死性細胞損傷能力的大小，數值上Dq=lnN×D0；D37是細胞存活分數相應于37%時所需要的輻射劑量，在單擊多靶模型中D37=D0+Dq。本實驗結果說明125I放射性粒子照射下的細胞存活曲線“肩區”大于X線的，反映了125I粒子照射克服“肩區”所需要的劑量大，積累亞致死損傷的能力弱。根據2018年美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)發布的頭頸腫瘤臨床實踐指南〔21〕，涎腺惡性腫瘤原發灶的根治性外放療應≥70 Gy(1.8～2.0 Gy/次)，術后放療應≥60 Gy(1.8～2.0 Gy/次)。而臨床上對于放射性125I粒子植入持續低劑量率治療涎腺癌，處方劑量遠遠大于外照射劑量，與本實驗結果相吻合。

RBE是比較不同的射線產生相同的生物學效應的一個直觀指標。通常以250 KeV的X射線為標準。X射線引起某種生物學效應所需要的吸收劑量與研究的電離輻射引起相同的生物學效應所需吸收劑量的比值，即為該種電離輻射的相對生物學效應。Marchese等〔22,23〕的研究證實，盡管實驗采用的細胞系以及生物檢測系統不盡相同，放射性125I粒子在相對于192Ir、60Co、226Ra、137Csγ射線，其RBE值位于1.0～1.5之間，范圍卻大致相同。Nath等〔24〕對中國倉鼠肺細胞系(CCL-16)進行照射，125I相對與250 KeV X線的RBE為1.08。可見不同的研究者們在一定的劑量率范圍內，在體內外實驗中得出的RBE均相應的位于一定的范圍內。本研究說明125I在不同癌細胞的放射生物效應相似。本實驗結果中125I照射腺樣囊性癌ACC-2細胞和照射前列腺癌PC-3細胞的放射生物參數近似，因此可以間接推導出125I粒子治療腺樣囊性癌的PD，即ABS推薦125I粒子治療前列腺癌140～160 Gy的PD作為治療腺樣囊性癌的PD。

本實驗從單一的細胞系受到放射性125I粒子持續低劑量率照射和X線照射的體外模型進行處方劑量的推導具有理論意義，但是，其精確性還需要動物實驗和大量的臨床病例進行驗證。

總之，放射性125I粒子組織間植入近距離治療涎腺癌已經被證明在抑制腫瘤增殖方面具有顯著療效，進一步研究其作用的分子機制及治療不同病理類型的涎腺腫瘤的最佳處方劑量是今后應該亟待解決的課題。