參芪復(fù)方對糖尿病性骨質(zhì)疏松大鼠骨轉(zhuǎn)換的影響

許騰飛 儲全根

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038)

糖尿病性骨質(zhì)疏松(DOP)是糖尿病較為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，致殘率、致死率均較高，據(jù)報(bào)道，糖尿病是骨質(zhì)疏松發(fā)展的重要因素，在糖尿病患者中，DOP發(fā)生率高達(dá)60%左右〔1〕。DOP患者骨損傷風(fēng)險(xiǎn)高，損傷后易出現(xiàn)愈合困難情況，故給予DOP患者安全有效的治療措施十分必要。目前，西醫(yī)治療DOP主要以降血糖、抗骨質(zhì)疏松藥物為主，雖然可在一定程度上改善患者癥狀，但因患者體質(zhì)不同，治療后易復(fù)發(fā)或治療期間易發(fā)生各類不良反應(yīng)，整體療效不佳〔2，3〕。中醫(yī)認(rèn)為糖尿病屬于“消渴”范疇，骨質(zhì)疏松屬“骨瘺”范疇，腎虛、血瘀是二者并發(fā)的重要病機(jī)，治療應(yīng)以活血化瘀、益氣養(yǎng)陰等為主〔4〕。參芪復(fù)方具有益氣養(yǎng)陰、活血散結(jié)等功效，可在一定程度上改善消渴患者氣陰兩虛狀態(tài)，對穩(wěn)定糖尿病患者血糖、改善骨骼肌病變具有重要作用〔5〕。但目前關(guān)于參芪復(fù)方治療DOP的具體作用機(jī)制尚未明確，本研究通過建立DOP大鼠模型，并使用不同劑量的參芪復(fù)方治療，擬分析參芪復(fù)方對DOP大鼠骨轉(zhuǎn)化的影響。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性SD大鼠50只均購自北京維利通華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，均為清潔級，周齡6～10 w，平均(7.16±1.03)w；體重0.15～0.26 kg，平均(0.22±0.05)kg；全部大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，每12 h晝夜交替1次，保證大鼠得到充足的食物及飲水量。

1.2主要藥品與試劑 骨化三醇膠丸由臺灣海默尼藥業(yè)有限公司提供，批準(zhǔn)文號：HC20171016，規(guī)格：0.25 μg/粒；參芪復(fù)方由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，由黃芪15 g、人參15 g、山藥10 g、山茱萸10 g、制大黃10 g、天花粉10 g等組成；0.9%氯化鈉注射液由成都科倫藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20181161，規(guī)格100 ml/瓶；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒均由廣州翔博生物公司提供。

1.3主要儀器與設(shè)備 北京正開儀器有限公司提供的電子秤；美國ALC公司提供的TGL-16B離心機(jī)；海爾公司提供的BCD-236HT低溫冰箱；成都神仙樹鍋爐廠醫(yī)藥設(shè)備廠提供的YMQWYZ消毒器；芬蘭Thermo公司提供的DENLEY DRAGON Wellscan MK 3型酶標(biāo)儀；美國 Media Cybernetics公司提供的Vevo2100超高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)、PRODIGY全自動雙能X線骨密度測量儀等。

1.4分組及藥物干預(yù)法 選取雄性SD大鼠50只，均進(jìn)行常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)選取其中10只作為空白對照組，將另40只建立DOP模型，建模成功后隨機(jī)分為4組，每組10只，分別設(shè)為模型組、骨化三醇組、中藥(參芪復(fù)方)低劑量組、中藥高劑量組。空白對照組普通飲食，不進(jìn)行任何藥物干預(yù)；模型組按照5 ml/(kg·d)劑量灌服無菌水；骨化三醇組給予骨化三醇生理鹽水稀釋后以0.04 μg/kg給藥；中藥低劑量組給予0.72 g/(kg·d)體重灌服參芪復(fù)方懸浮液；中藥高劑量組給予2.88 g/(kg·d)體重灌服參芪復(fù)方懸浮液。

1.5建立DOP模型 除空白對照組外，其余動物建立DOP模型：以高糖高脂飼料喂養(yǎng)，在常規(guī)飼料基礎(chǔ)上，加入20%蔗糖、15%熟豬油等，喂養(yǎng)4 w；在禁食不禁飲12 h后，于大鼠左下腹部處注射鏈脲佐菌素30 mg/kg；腹腔注射鏈脲佐菌素后持續(xù)給予高脂、高糖飼料喂養(yǎng)6 w；之后采集尾靜脈血樣測量血糖水平，若血糖值均超過16.7 mmol/L即糖尿病造模成功；糖尿病大鼠成模7 w后，采用PRODIGY全自動雙能X線骨密度測量儀測量對照組及模型組全身骨密度，測定方法：大鼠依據(jù)35 mg/kg體重劑量給予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取仰臥位，保持四肢外展避免掃描重疊，若骨密度<對照組大鼠平均骨密度2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，則判定為DOP建模成功。

1.6檢測相關(guān)指標(biāo) 治療12 w，用3%戊巴比妥鈉對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，打開胸腔，心臟取血10～12 ml，以2 000 r/min離心10～15 min，取上清液，置于-80℃冰箱中保存；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)〔抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、堿性磷酸酶(ALP)〕、血清相關(guān)指標(biāo)〔胰高血糖素樣多肽(GLP)-1、胰島素樣生長因子(IGF)-1〕、細(xì)胞因子〔腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6〕。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)、單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.15組骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)比較 與空白對照組比較，其他4組TRACP、ALP明顯升高(P<0.05)；骨化三醇組、中藥低劑量組、高劑量組低于模型組，中藥低劑量組、高劑量組低于骨化三醇組，且中藥高劑量組低于中藥低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.25組血清相關(guān)指標(biāo)比較 與空白對照組比較，其他4組GLP-1、IGF-1明顯降低(P<0.05)；骨化三醇組、中藥低劑量組、高劑量組高于模型組，中藥低劑量組、高劑量組高于骨化三醇組，且中藥高劑量組較中藥低劑量組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.35組細(xì)胞因子指標(biāo)比較 與空白對照組比較，其他4組TNF-α、IL-6水平明顯升高(P<0.05)；骨化三醇組、中藥低劑量組、高劑量組低于模型組，中藥低劑量組、高劑量組低于骨化三醇組，且中藥高劑量組低于中藥低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 5組骨轉(zhuǎn)換、血清、細(xì)胞因子相關(guān)指標(biāo)比較

3 討 論

糖尿病患者鈣磷代謝紊亂，易引起骨質(zhì)疏松，目前關(guān)于DOP具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，動物實(shí)驗(yàn)顯示，骨膠原蛋白結(jié)構(gòu)改善可能與DOP發(fā)生及發(fā)展有一定聯(lián)系〔6〕。研究顯示，DOP加大患者骨折損傷風(fēng)險(xiǎn)，對患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響〔7〕。因此，探尋DOP積極有效的治療方案至關(guān)重要，對降低患者骨折損傷風(fēng)險(xiǎn)具有一定意義。

常規(guī)西藥治療雖能改善DOP患者臨床表現(xiàn)，降低骨折損傷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但存在易復(fù)發(fā)、不良反應(yīng)多等情況，在一定程度上限制療效〔8〕。中醫(yī)理論認(rèn)為DOP屬于“消渴”“骨瘺”等范疇，二者病機(jī)均為腎虛內(nèi)燥導(dǎo)致脈絡(luò)瘀滯，故應(yīng)從“腎”論治，治療應(yīng)以活血化瘀、補(bǔ)腎強(qiáng)骨等為主〔9〕。參芪復(fù)方具有益氣養(yǎng)血、活血化瘀等功效，方中黃芪、人參養(yǎng)陰生津、益氣祛濕；山藥、天花粉可強(qiáng)筋骨、益氣養(yǎng)陰、生津止渴；山茱萸滋陰養(yǎng)液、補(bǔ)益肝腎；制大黃活血化瘀、清熱解毒，諸藥為伍，共奏益氣滋陰、活血化瘀等功效〔10〕。研究顯示，參芪復(fù)方可有效降低血糖，改善糖脂代謝，同時(shí)具有較好的穩(wěn)定血糖的作用〔11〕。

骨轉(zhuǎn)換主要包括骨形成、骨吸收，TRACP是由破骨細(xì)胞分泌而成，被認(rèn)為是骨吸收、破骨細(xì)胞活性的良好標(biāo)志物，利于了解正常條件及病理?xiàng)l件下骨代謝情況〔12〕。ALP與成骨細(xì)胞活性具有一定聯(lián)系，其水平升高提示成骨細(xì)胞活性有所增強(qiáng)，屬于骨轉(zhuǎn)換的重要指標(biāo)之一〔13〕。IGF-1是骨形成重要標(biāo)志物，可增加成骨細(xì)胞數(shù)目，調(diào)節(jié)骨吸收狀態(tài)，維持骨量平衡，同時(shí)還可促進(jìn)骨轉(zhuǎn)換〔14〕。GLP-1是骨形成的強(qiáng)刺激因子，對骨代謝具有促進(jìn)作用，不僅可有效控制血糖，還可減緩DOP進(jìn)程，有效保護(hù)骨質(zhì)〔15〕。本研究結(jié)果提示參芪復(fù)方治療DOP大鼠，利于降低大鼠骨組織高轉(zhuǎn)換狀態(tài)。分析其原因可能與參芪復(fù)方利于促進(jìn)肌肉玄府通暢，進(jìn)而使得肌肉不得滋養(yǎng)狀態(tài)得以改善有關(guān)。但具體作用機(jī)制還未明確〔16〕。

TNF-α、IL-6均是促進(jìn)骨吸收的重要細(xì)胞因子，其中IL-6到達(dá)一定濃度時(shí)，可激活破骨細(xì)胞，具體表現(xiàn)為破骨細(xì)胞中相關(guān)膠原酶表達(dá)量異常升高，進(jìn)而起到調(diào)節(jié)骨膠原代謝作用〔17〕。TNF-α對增強(qiáng)破骨細(xì)胞形成具有一定作用，其水平升高可促進(jìn)IL-6分泌，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)骨代謝作用〔18〕。本研究結(jié)果提示參芪復(fù)方治療DOP大鼠，可降低TNF-α、IL-6水平，但因參芪復(fù)方在DOP中具體作用機(jī)制尚未明確，且相關(guān)研究較少，故本研究結(jié)果可靠性還需日后臨床進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，參芪復(fù)方可降低DOP大鼠骨組織高轉(zhuǎn)換狀態(tài)，提高IGF-1、GLP-1表達(dá)，降低TNF-α、IL-6表達(dá)，進(jìn)而提高大鼠骨密度，具有較好應(yīng)用價(jià)值。