抗PEDV血清對仔豬流行性腹瀉防控效果研究

尹寶英,張文娟,朱小甫,張 浩

(1.咸陽職業技術學院 畜牧獸醫研究所 咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室，陜西 咸陽 712000; 2.陜西正大有限公司，陜西 咸陽 712000)

豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhea, PED)是我國2010年以來阻礙養豬業健康穩定發展的主要疫病之一[1～2]。感染PED的豬只主要臨床表現為嘔吐、腹瀉和脫水，PED病毒會引起初生哺乳仔豬脫水死亡，致死率可高達100%。另因腹瀉造成的母豬發情異常、流產、仔豬殘次率高等間接損失難以估算[3]。該病在全國各地呈暴發流行，近年發生的季節性越來越不明顯，部分豬場呈間歇性發病。2018年對陜西部分規模化豬場送檢的162份腹瀉樣品檢測結果中PEDV的陽性檢出率分別為16.04%[4]，對陜西省養豬業造成了巨大的經濟損失。

PED目前的防控主要是通過給妊娠母豬接種疫苗，讓仔豬通過初乳以被動免疫的方式獲得抵抗力，但由于該病存在發病日齡早、混合感染、病毒的基因變異以及商品疫苗免疫效果不理想等諸多問題，市售商品苗并沒有起到理想的防護效果，PED復發始終存在[5]。國外豬場在發生 PED 時，通常采用返飼技術，使豬群在短期內集中感染，刺激母豬產生抗PED病毒抗體[6～7]。本實驗采用返飼制備高免血清對陜西某頻發PED豬場進行防治的效果觀察，旨在探索和篩選在臨床上治療豬流行性腹瀉的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源和實驗動物 病料來自咸陽地區養豬場3～7日齡發生PED初期的仔豬腸道樣本。病豬表現精神不振，食欲差，嘔吐，頻頻拉白色、黃白色或黃綠色水樣稀糞，嚴重脫水；嘔吐、脫水和死亡。樣品在-80℃ 冰箱保存；昆白鼠20只；產前90 d妊娠母豬6頭。

1.1.2 材料 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa9766)、PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRa RR055B)、瓊脂糖(AOBOX)均購自寶生物工程(大連)有限公司；PDEV ELISA抗體檢測試劑盒(青島捷世康)、50×TAE( 北京博奧拓達)、0.9% 生理鹽水、雙抗、LB 培養基等均為國產化學試劑。

1.1.3 引物設計 根據GenBank中公布的PEDV毒株全基因序列( 登錄號為 AF353511)，通過Premier 5.0軟件設計，5’-GAA GTA ACC ACG GTC GTG-3’，5’-GCT CTC GAA CAG CCC CAT TA-3’目的擴增基因片段長度為495 bp，與偽狂犬、豬瘟、傳染性胃腸炎、輪狀病毒和圓環病毒等病原引物合成由生工生物工程( 上海) 有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 返飼材料制備 返飼材料為3日齡內發病，24 h內確診PED的仔豬的整段腸道及內容物，經RT-PCR病原檢測，偽狂犬、豬瘟、傳染性胃腸炎、輪狀病毒和圓環病毒等病原檢測為陰性。稱重按每100 g加入100 mL含青鏈霉素各60萬單位的生理鹽水，用組織搗碎機勻漿，48 h內冷藏使用。

1.2.2 血清制備 將上述制備好的抗原組織按每頭豬50 mL量返飼健康豬只，次日以超30%的豬只出現嘔吐、腹瀉、厭食為標準，進行第二輪返飼，二次返飼后出現臨床癥狀豬只比例超過90%，證明返飼成功。二次返飼后每隔3 d清晨空腹經前腔靜脈無菌采血，自然凝固分離血清，進行PEDV IgG抗體檢測大量采集達到峰值血清作為備用高免血清，56 ℃滅活1.5 h，自然冷卻后，加入青鏈雙抗，密封冷凍保存備用。

1.2.3 抗血清檢驗 無菌檢查：將分離的血清分別接種于普通培養基與鮮血瓊脂培養基，37℃培養18～24 h后觀察是否有菌落生長。

安全性試驗：將培養無細菌生長的血清對體重18～22 g的健康小白鼠5只進行皮下注射，每只0.5 mL，觀察一周，每日量體溫，觀察是否發病。

特定病原檢測：對備用篩選血清、返飼供體豬只的糞便和肛門拭子進行特定病原檢測。

1.2.4 預防試驗 隨機選取發病豬場PED免疫母豬所產初生仔豬，試驗組22頭，對照組26頭。試驗組于仔豬出生后2 h內每頭灌服高免血清5 mL，隔日再灌服1次。對照組不做處理。試驗日至斷奶日期間觀察豬只有無出現嘔吐，黃白色或黃綠色水樣稀糞等PED臨床癥狀，判斷保護率。

1.2.5 治療試驗 選用發病豬場自然發病初生仔豬，經診斷為PED感染的4窩仔豬47頭，根據分娩先后，按自然窩，隨機分成2個組，即血清治療組與常規藥物治療對照組，血清治療組2窩23頭，視患豬的日齡，體重大小，每頭每次灌服自制血清3～4 mL。如24 h內未痊愈的，可再注射同樣劑量1次。藥物治療組(黃芪多糖，楊樹花 )2窩24頭，按患病仔豬的體重大小，采取不同劑量分別口服黃芪多糖和楊樹花，每天2次，連續2 d。試驗期間密切觀察仔豬臨床變化，3 d內精神恢復正常，腹瀉停止，精神、食欲、糞便狀態恢復正常，判斷為治愈。否則，判為無效。

2 結果

2.1 PEDV抗體檢測

用ELISA方法檢測返飼后血清中PEDV IgG抗體水平，計算平均值。如圖1所示，IgG抗體水平峰值出現在返飼后第19天，均值可達到1.836，高水平表達至第25天左右。

2.2 高免血清的無菌檢査、安全性試驗和PEDV檢測

將滅活測定高效價血清分別接種于普通培養基、鮮血瓊脂培養基，置于培養箱培養, 未發現任何細菌生長；皮下注射昆白鼠未發現異常反應。流行性腹瀉、偽狂犬、豬瘟、傳染性胃腸炎、輪狀病毒和圓環病毒等病原檢測為陰性。

2.3 高免血清預防試驗

預防試驗仔豬在20日齡內未出現大規模嘔吐，頻頻拉白色、黃白色或黃綠色水樣稀糞等癥狀。由表1數據可知，高免血清+疫苗組和疫苗組的發病率為9.09%和38.46%，截止斷奶期高免血清+疫苗組和疫苗組的淘汰率分別為13.64%和26.92%，差異顯著(P<0.05)。

表1 預防效果比較

2.4 高免血清治療試驗

由表2可知，治療，高免血清組和藥物對照組對PED的治愈率分別為82.6%和16.67%，未治愈死亡率分別為17.4%和83.3%。高免血清組與藥物對照組之間有極顯著差異 (P<0.01)。

表2 治療效果比較

3 小結與討論

豬流行性腹瀉是近年來困擾養豬業的一項重大腸道傳染病，但由于毒株差異以及疫苗實際應用程序復雜而保護率差異很大。大多數情況下，PEDV的感染仍然是能引起仔豬大量死亡的棘手疾病。僅僅依靠商品疫苗免疫很難及時有效防控PED造成巨大損失。臨床上常常返飼妊娠母豬利用人工自然免疫使得妊娠母豬在短期內集中感染，從而在分娩時獲得高效的母源抗體[6]，利用母源抗體保護后代仔豬度過危險期。國內由于豬場病原比較復雜，因返飼后部分母豬持續排毒，反復爆發，導致返飼風險措施的安全性和有效應用不被認可[5～8]。筆者應用場內返飼方法制備高免血清，既能針對性的保證病原的較高抗原性又能保證的安全性。筆者研究通過給成年健康豬2只次大量的返飼后采取第19天IgG處于峰值期的高免血，清效價均值1.84，同時PED病原檢測為陰性。進行臨床預防治療試驗，結果顯示本研究制備的高免血清可以提供的93.2%的保護率和87.5%的治愈率，防治效果非常顯著，說明該方法自制高免血清能起到較好的預防與治療效果，具有很高的臨床價值，同時操作簡單、安全有效。

初生仔豬腹瀉原因復雜，因此血清治療必須配合科學分析進行防治，并要根據實際情況加強母豬、仔豬飼養管理，做好保溫、衛生等環境工作；合理防疫，及時讓初生仔豬吃足初乳，增強仔豬抵抗力；必要時采用結合抗生素治療，才能更好地發揮防治作用。