野黃芩素在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究

李遠(yuǎn)志 王鈞冬 岳朝馳 龍 慶 李 俊

1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科，四川瀘州 646000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脾胃病科，四川成都 610000

結(jié)腸癌是全球第三大常見的惡性腫瘤和第四大癌癥死亡原因[1]。目前結(jié)腸癌的主要治療方式是手術(shù)輔以放療或化療，然而患者的5年生存率僅為65.2%[2]，表明目前的治療方法無法根除癌細(xì)胞。因此，急需尋找新的治療結(jié)腸癌的有效方法。中藥半枝蓮的主要活性成分野黃芩苷，是一種主要由肽多糖等構(gòu)成的黃酮類化合物，具有抗腫瘤的作用[3-4]。野黃芩素作為野黃芩苷的苷元，更易吸收，生物活性更高，生物利用度更好[5]，但其抗結(jié)腸癌作用及相關(guān)機(jī)制報(bào)道較少。因此，本研究擬探索野黃芩素在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其相關(guān)機(jī)制，為野黃芩素在臨床治療結(jié)腸癌提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人結(jié)腸癌細(xì)胞系T84 購買于上海北諾生物科技有限公司；15 只雄性無胸腺BALB/C 裸鼠，SPF 級，5～6 周齡，體重18～20 g，購買于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-030。裸鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中，12 h 明暗周期自動(dòng)交替，采取自由采食，自由飲水的方式喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)已報(bào)備醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.1.2 主要試劑及耗材 本研究所需要的試劑及耗材購買均來源于北京傲銳東源生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 將野黃芩素溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，制成100 mM 的母液備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) T84 細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清、2.5 mM 谷氨酰胺的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為溫度37℃，CO2濃度5%，間隔一天更換細(xì)胞液直至細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%后進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染之前的24 h，按照密度為5×105/mL 的標(biāo)準(zhǔn)在24 孔培養(yǎng)瓶中進(jìn)行細(xì)胞接種，采用脂質(zhì)體lipofectamine 2000 將對照載體和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到T84 細(xì)胞里，隨后對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率則進(jìn)行檢測。

1.2.4 Western Blot 檢測蛋白表達(dá) 將細(xì)胞加入100 μL 計(jì)量的RIPA 裂解液，裂解、變性，同時(shí)經(jīng)BCA定量，隨后取蛋白20 μg 進(jìn)行電泳分離，后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉液中進(jìn)行時(shí)長1 h 的常溫封閉，4℃環(huán)境下一抗過夜孵育，清洗，之后對二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）進(jìn)行時(shí)長1 h 的室溫孵育，同時(shí)化學(xué)熒光顯色。內(nèi)對照為GAPDH。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）采用Trizol 試劑提取細(xì)胞中的總RNA，后將其逆轉(zhuǎn)成cDNA 后按照試劑盒相關(guān)說明進(jìn)行RT-PCR，后采用2-Ct 方法對mRNA 的含量進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列如下。EGFR-正向引物：5′-CCCTCCTGAGCTCTCTGAGT-3′，EGFR-反向引物：5′-GTTTCCCCCTCTGGAGATGC-3′；GAPDH-正向引物：5′-CTCCTGTTCGACAGTCAGCCG-3′，GAPDH-反向引物：5′-CCTAGCCTCCCGGGTTTCTC-3′。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 胰酶消化細(xì)胞后，收集細(xì)胞使每組細(xì)胞不少于3×105個(gè)細(xì)胞，每組細(xì)胞設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，冰浴PBS 清洗2 遍，1000 r/min 離心5 min，留取細(xì)胞沉淀，每組加入1×Annexin V Binding Buffer 100 μL，充分混勻細(xì)胞，將5 μL FITC Annexin V 染液，5 μL PI 染液加入到每組細(xì)胞中，避光室溫反應(yīng)，時(shí)長15 min，然后每管加300 μL 1×Annexin V Binding Buffer 溶液，1 h 流式細(xì)胞儀檢測[6]。

1.2.7 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 調(diào)整T84 細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，將懸浮液均勻后的200 μL 細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行接種，等到細(xì)胞貼壁之后，加入濃度分別為10、20、40、80、160 μmol/L 的野黃芩素，同時(shí)設(shè)置空白對照組，5 個(gè)復(fù)孔/組。在分別24、48、72 h 培養(yǎng)時(shí)長后，對培養(yǎng)基（200 μL 計(jì)量）進(jìn)行更新，同時(shí)加入濃度為5 g/L 的MTT 溶液20 μL 孵育4 h，舍棄上清，加入DMSO 200 μL 后震蕩10 min，測定吸光度A（波長處為570 nm），對半數(shù)抑制濃度（IC50）進(jìn)行計(jì)算。細(xì)胞增殖抑制率=（1-A藥物組/A空白組）×100%。

1.2.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 用不含血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基制成1×106個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，加入6 孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)用無菌20 μL 的白槍頭垂直劃出3 道直線，后加藥物處理，觀察細(xì)胞的愈合情況。劃痕后0 h 和24 h拍照。

1.2.9 Transwell 小室檢測細(xì)胞侵襲能力 ①包被基底膜：先按Matrigel 膠1 倍，培養(yǎng)基3 倍配制Matrigel膠稀釋液，后取40 μL Matrigel 膠稀釋液將Transwell小室底部膜的上室包被，4℃環(huán)境下風(fēng)干[7]。②接種細(xì)胞：將T84 細(xì)胞用不含血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，將細(xì)胞密度調(diào)整到2×105/mL，于Transwell 小室上室中加入200 μL 細(xì)胞懸液，同時(shí)取600 μL 含20% FBS 的完全培養(yǎng)基加入到24 孔板下室，之后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行時(shí)長48 h 的細(xì)胞培養(yǎng)[8]。③結(jié)果判斷：48 h 后將Transwell 膜棄去上清，PBS 沖洗3 次；冷的無水甲醇固定10 min，空氣干燥，結(jié)晶紫染色5 min；用棉簽將上層未遷移細(xì)胞擦去，PBS 沖洗3 次[9]；顯微鏡下觀察，拍照，200 倍鏡下計(jì)算平均數(shù)。

1.2.10 免疫共聚焦 將2×104個(gè)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，均勻接種在放置載玻片的24 孔板中，第2 天加野黃芩素（30 μmol/L）處理細(xì)胞，48 h 后，用多聚甲醛（4%）進(jìn)行10 min 固定，Triton X-100 孵育10 min 后將細(xì)胞膜穿透；用20%的山羊血清（PBST 配制），室溫封閉1 h；玻片放在濕盒中，滴加一抗工作液（ERK1/2）4℃孵育過夜，后滴加二抗工作液室溫孵育1 h，DAPI 孵育5 min，抗衰減熒光封片劑封片后在共聚焦顯微鏡（200 倍鏡）下采圖。

1.2.11 荷瘤實(shí)驗(yàn) 本研究在結(jié)腸癌細(xì)胞T84 中過表達(dá)了EGFR，并將15 只BALB/C 裸鼠隨機(jī)分為對照組、野黃芩素組及野黃芩素+EGFR 過表達(dá)組，每組5 只裸鼠。取1×107處于對數(shù)生長期的T84 細(xì)胞及EFGR 穩(wěn)定過表達(dá)的T24 細(xì)胞，重懸于200 μL PBS，于BALB/C 裸鼠雙側(cè)腋下接種，待腫瘤大小為1 cm3左右且肉眼可見時(shí)，將野黃芩素組及野黃芩素+EGFR過表達(dá)組小鼠給予野黃芩素[20 mg/（kg·周）]灌胃，共2 次，對照組不作處理。后于細(xì)胞接種28 d 后殺死各組小鼠取腫瘤，檢測腫瘤的大小和質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用One-Way ANOVA 檢測，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 野黃芩素對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著野黃芩素作用時(shí)間的延長及藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率越來越高，且野黃芩素作用24、48 及72 h 的IC50值分別為78.5、36.7、和25.6 μmol/L（圖1A）。基于此研究，在接下來的實(shí)驗(yàn)中筆者將野黃芩素組的使用濃度定為30 μmol/L，與空白對照組進(jìn)行比較，兩組的作用時(shí)間定為48 h。通過Western Blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野黃芩素組較空白對照組的Bax、caspase3 及caspase9 的表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2 的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）（圖1B）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，同對照組相比，野黃芩素處理后細(xì)胞的凋亡比例上升（P＜0.05）（圖1C）。

2.2 野黃芩素對結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的影響

通過劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，野黃芩素組可明顯降低結(jié)腸癌T84 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力（P＜0.05）（圖2）。

圖2 野黃芩素對結(jié)腸癌T84 細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的影響

2.3 野黃芩素對EGFR/ERK1/2 通路的影響

同對照組相比，野黃芩素組EGFR 和p-ERK1/2的蛋白水平均降低（P＜0.01）（圖3A），并促進(jìn)ERK1/2出核（圖3B），同時(shí)降低ERK1/2 通路下游轉(zhuǎn)錄因子c-myc、c-fos 的表達(dá)（P＜0.01）（圖3C）。

圖3 野黃芩素對T84 細(xì)胞中EGFR/ERK1/2 通路的影響

2.4 野黃芩素對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及與EGFR/ERK/1/2 通路的相關(guān)性研究

轉(zhuǎn)染EGFR 的過表達(dá)質(zhì)粒明顯促進(jìn)了EGFR 的表達(dá)（P＜0.05）（圖4A）。與野黃芩素組相比，野黃芩素+EGFR 過表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力升高（P＜0.05）（圖4B），且體外成瘤能力明顯增強(qiáng)（P＜0.01）（圖4C），凋亡水平降低（P＜0.05）（圖4D）。

圖4 野黃芩素對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及與EGFR/ERK/1/2 通路的相關(guān)性

3 討論

野黃芩苷是半枝蓮的主要活性成分，可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)以及促進(jìn)內(nèi)皮型-氧化氮合酶（endothelial-nitric oxide synthase，eNOS）表達(dá)來改善腦血管功能[10-11]；此外，其可通過降低Bcl-2/Bax 的比值[12]，提高天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific protease，caspase）的表達(dá)[13]，激活Fas及FasL 死亡受體蛋白的表達(dá)[14]促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤作用。野黃芩素是野黃芩苷的苷元和其體內(nèi)吸收的主要水合形式，其生物利用度為野黃芩苷的3 倍[15]。近年來，Cheng 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，野黃芩素可抑制肺癌A549 細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果提示，野黃芩素可明顯降低結(jié)腸癌T84 細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)其凋亡，并降低結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力，顯著抑制了體外腫瘤生成。此外，本研究結(jié)果還顯示，野黃芩素處理可降低EGFR、p-ERK1/2 的表達(dá)，提示野黃芩素可抑制EGFR/ERK1/2 通路的激活。EGFR 是分布于細(xì)胞表面的糖蛋白，可促進(jìn)ERK1/2 蛋白激活，并進(jìn)入細(xì)胞核在c-myc、c-fos 等轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)揮作用，進(jìn)而達(dá)到提高某些癌基因的高表達(dá)與異常轉(zhuǎn)錄的效果[17]。多項(xiàng)研究表明，EGFR 在多種腫瘤組織或細(xì)胞中被過度激活并通過激活其下游ERK1/2 信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[18-19]。Zhang 等[20]發(fā)現(xiàn)下調(diào)HOXA3 表達(dá)介導(dǎo)的EGFR/ERK 通路抑制可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的成瘤能力。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)野黃芩素可促進(jìn)ERK1/2 蛋白出核，并抑制其下游轉(zhuǎn)錄因子c-myc、c-fos 的表達(dá)，進(jìn)一步表明野黃芩素可抑制EGFR/ERK1/2 通路的激活。此外，為了探究EGFR/ERK1/2 通路參與調(diào)控野黃芩素的抑癌機(jī)制，本研究在EGFR 過表達(dá)的基礎(chǔ)上給予細(xì)胞野黃芩素處理，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，凋亡受到抑制。小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)同樣也證明野黃芩素的抑癌作用在EGFR 過表達(dá)后受到顯著抑制。

綜上所述，野黃芩素可通過抑制EGFR/ERK1/2通路的激活抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，為野黃芩素應(yīng)用于結(jié)腸癌患者的臨床治療提供了理論依據(jù)。