全反式維甲酸通過調(diào)控sFlt?1表達(dá)對滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲及促血管形成能力的影響

陽雙健 鐘黎黎 盛瑩 郭江虹 何宜靜

1南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院，附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科（湖南衡陽421001）；2南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院，附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科（湖南衡陽421001）

子癇前期（PE）屬于妊娠期特有疾病，指孕婦在懷孕20 周以后出現(xiàn)以高血壓、蛋白尿為主要臨床表現(xiàn)的一組臨床綜合征［1］。既往研究顯示［2?3］，胎盤生長因子（PIGF）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）含量在子癇前期患者的胎盤組織及血清中降低，而可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1（sFlt?1）含量升高，表明胎盤血管發(fā)育異常與子癇前期形成有關(guān)。全反式維甲酸（ATRA）是維生素A 的生物活性衍生物，在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡的作用［4?5］。有研究［6］指出，ATRA 在子癇前期患者子宮脫膜組織中低表達(dá)，胎盤中ATRA 異常表達(dá)可能影響到滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤過程，但ATRA 在此過程中是否參與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、遷移等過程的調(diào)控以及具體機(jī)制尚未明確。因此，本研究擬初步探討ATRA 對滋養(yǎng)細(xì)胞sFlt?1 表達(dá)的影響以及ATRA 通過調(diào)控sFlt?1 表達(dá)對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及促血管形成能力產(chǎn)生影響，以期為ATRA 治療子癇前期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR?8/SVneo 購自美國模式菌種收集中心（ATCC）；ATRA 購自美國Sigma 公司；sFlt?1、基質(zhì)金屬蛋白酶?2（MMP?2）、基質(zhì)金屬蛋白酶?9（MMP?9）和GAPDH 抗體均購自美國Abcam 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Hy?Clone 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR 試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；sFlt?1 過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及慢病毒包裝、濃縮及純化由漢恒生物科技（上海）公司完成；PIGF、sFlt?1 和VEGF ELISA 試劑盒購自上海卡努生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HTR?8/SVneo 細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含1%青霉素?鏈霉素溶液和5%胎牛血清的RP?MI1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)傳代。

1.2.2 ATRA 干預(yù)后細(xì)胞中sFlt?1 表達(dá)檢測 取對數(shù)生長期HTR?8/SVneo 細(xì)胞，按照1 × 106個/mL的細(xì)胞數(shù)接種于6 孔板，待細(xì)胞生長至60%融合度時，采用0.15 μmol/L ATRA 分別處理細(xì)胞0、12、24、48、72 h，然后采用qRT?PCR 和ELISA 法分別檢測細(xì)胞中sFlt?1 mRNA 表達(dá)水平及蛋白含量。

1.2.3 細(xì)胞感染及分組處理 待細(xì)胞生長至60%融合度時，分別取陰性對照慢病毒（Vector）和sFlt?1 過表達(dá)質(zhì)粒慢病毒（Lv?sFlt?1）感染HTR?8/SVneo細(xì)胞（感染比例為1∶50），另設(shè)未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞作為空白對照組（blank），分別記為Lv?sFlt?1 組、Vector 組和blank 組。感染8 h 后吸除原培養(yǎng)基，更換為新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h 后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)株，分別采用RT?PCR 和Western blot實驗驗證sFlt?1 過表達(dá)效果。而后將細(xì)胞分為4組：（1）對照組（Control）：HTR?8/SVneo 細(xì)胞不經(jīng)任何處理；（2）ATRA 組：HTR?8/SVneo 細(xì)胞經(jīng)0.15 μmol/L ATRA 處理24 h；（3）Lv?sFlt?1 組：穩(wěn)定過表達(dá)sFlt?1 的HTR?8/SVneo 細(xì)胞不經(jīng)任何處理；（4）ATRA+Lv?sFlt?1 組：穩(wěn)定過表達(dá)sFlt?1 的HTR?8/SVneo 細(xì)胞經(jīng)0.15 μmol/L ATRA 處理24 h。

1.2.4 qRT?PCR 檢測細(xì)胞中sFlt?1 mRNA 表達(dá)水平 收集細(xì)胞，采用Trizol 法取總RNA，通過紫外分光光度計檢測總RNA 的含量及純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為下一步PCR模版，sFlt?1 上游引物序列5′?GCAC CTTGGTTGTG?GCTGACT?3′，sFlt?1 下游引物序列5′?GGGC CC?GGGGGTCTCA TTATT?3；GAPDH 上游引物序列5′?ACTAG GCGCTCACTGTTCTC?3′，下游引物序列5′?AT CCGTTGACTCCGACCTTC?3′。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，4 倍梯度稀釋模板cDNA 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確認(rèn)各個基因的擴(kuò)增效率，確定cDNA 上樣濃度。根據(jù)反應(yīng)條件在每個循環(huán)延伸末端收集熒光信號，繪制擴(kuò)增曲線。PCR 擴(kuò)增儀按照95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸20 s的條件擴(kuò)增40 次。采用2?△△Ct法計算sFlt?1 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.5 ELISA 檢測細(xì)胞上清中sFlt?1、PIGF 和VEGF 蛋白含量 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，5 000 g離心10 min，收集上清，具體操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞培養(yǎng)上清中sFlt?1、PIGF 和VEGF 蛋白含量。

1.2.6 Western blot 檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞并加入RIPA 細(xì)胞裂解液，置于冰上作用30 min，12 000 g 離心15 min，取上清液用BCA 法測定蛋白濃度并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜，50 mol/L 脫脂牛奶封閉，加入一抗孵育過夜，稀釋比均為1∶500。4 ℃過夜，次日TBST 洗脫3 次，對應(yīng)加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗脫3 次，用ECL 發(fā)光液發(fā)光顯色，在自動凝膠成像分析系統(tǒng)成像，使用Image J 軟件進(jìn)行分析，以GAPDH 為內(nèi)參計算總蛋白相對表達(dá)量。

1.2.7 Transwell 法檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力 取24 孔板Transwell 小室，使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以每孔2 × 105的細(xì)胞密度接種于PBS 提前濕潤的Transwell 小室上室聚碳酸酯微孔膜上，每孔加200 μL 無血清培養(yǎng)基。將600 μL 完全培養(yǎng)基加入下室，作為趨化因子，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察穿過掉入下室5 個細(xì)胞時終止培養(yǎng)，PBS 洗3 次，甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，晾干后取出聚碳酸酯微孔膜。于顯微鏡下隨機(jī)計數(shù)5 個視野膜上的細(xì)胞數(shù)目，取其均值，代表細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。細(xì)胞侵襲實驗時Tran?swell 小室上室提前加入Matrigel 膠后接種細(xì)胞，剩下操作同遷移實驗。

1.2.8 小管形成實驗檢測細(xì)胞體外促血管形成能力 將Matrigel 基質(zhì)膠提前放入4 ℃冰箱過夜，融化后加入到96 孔板中凝膠。取各組HUVEC 細(xì)胞上清液，2 000 g 離心5min，收集上清后重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/mL，隨后向鋪好基質(zhì)膠的96 孔板中每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，置于37 ℃5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞成管情況并拍照，并隨機(jī)取5 個視野統(tǒng)計小管形成數(shù)量取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗均重復(fù)3 次，采用SPSS 22 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析或連續(xù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATRA 抑制HTR?8/SVneo 細(xì)胞中sFlt?1 的表達(dá) 見圖1，隨著0.15 μmol/L ATRA 處理時間的延長，HTR?8/SVneo 細(xì)胞中sFlt?1 mRNA 表達(dá)水平及上清液中sFlt?1 蛋白含量逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FsFlt?1mRNA=11.20，F(xiàn)sFlt?1蛋白=49.66，P＜0.001）。與0 h 時間點比較，0.15 μmol/L ATRA 處理24、48、72 h 時，HTR?8/SVneo 細(xì)胞中sFlt?1 mRNA 表達(dá)水平及上清液中sFlt?1 蛋白含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），根據(jù)該結(jié)果選擇24 h 作為后續(xù)實驗時間點。

圖1 ATRA 對HTR?8/SVneo 細(xì)胞中sFlt?1 表達(dá)的影響Fig.1 Effect of ATRA on the expression of sFlt?1 in HTR?8/SVneo cells

2.2 過表達(dá)sFlt?1 后HTR?8/SVneo 細(xì)胞中sFlt?1的表達(dá)水平 見圖2，與blank 組或Vector 組比較，Lv?sFlt?1 組細(xì)胞中sFlt?1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.001），表明成功構(gòu)建sFlt?1 過表達(dá)的HTR?8/SVneo 細(xì)胞。

圖2 各組細(xì)胞中sFlt?1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平Fig.2 The mRNA and protein expression levels of sFlt?1 in each group

2.3 ATRA 對HTR?8/SVneo 細(xì)胞中sFlt?1、PIGF和VEGF 蛋白分泌的影響 見圖3，與Control 組比較，ATRA 組細(xì)胞上清液中sFlt?1 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），PIGF 和VEGF 蛋白含量顯著升高（P均＜0.01）；而Lv?sFlt?1 組細(xì)胞上清液中sFlt?1 蛋白含量顯著升高（P＜0.01），PIGF 和VEGF 蛋白含量顯著降低（均P＜0.05）；與ATRA 組比較，ATRA+Lv?sFlt?1 組細(xì)胞上清液中sFlt?1 蛋白含量顯著升高（P＜0.01），而PIGF 和VEGF 蛋白含量顯著降低（均P＜0.01）。2.4 ATRA 對HTR?8/SVneo 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 見圖4、5，與Control 組比較，ATRA 組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著增加（P＜0.001），而Lv?sFlt?1 組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P＜0.001）；與ATRA 組比較，ATRA+Lv?sFlt?1 組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P＜0.001）。見圖6，與Control 組比較，ATRA 組細(xì)胞中MMP?9 和MMP?2蛋白水平均顯著上調(diào)（P＜0.001），而Lv?sFlt?1 組細(xì)胞中MMP?9 和MMP?2 蛋白水平均顯著下調(diào)（P＜0.001）；與ATRA 組比較，ATRA+Lv?sFlt?1 組細(xì)胞中MMP?9 和MMP?2 蛋白水平均顯著下調(diào)（P＜0.001）。

圖3 各組細(xì)胞上清液中sFlt?1、PIGF 和VEGF 蛋白含量比較Fig.3 Comparison of the protein contents of sFlt?1，PIGF and VEGF in the supernatant of each group

圖4 各組細(xì)胞遷移能力比較（×200）Fig.4 Comparison of the migration ability of cell in each group（×200）

圖5 各組細(xì)胞侵襲能力比較（×200）Fig.5 Comparison of the invasion ability of cell in each group（×200）

圖6 各組細(xì)胞中MMP?2 和MMP?9 蛋白表達(dá)水平Fig.6 Comparison of the protein expression levels of MMP?2 and MMP?9 in each group

2.5 ATRA 對HTR?8/SVneo 細(xì)胞促血管形成能力的影響 見圖7，與Control 組比較，ATRA 組細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞血管成管數(shù)量顯著增加（P＜0.001），而Lv?sFlt?1 組細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞血管成管數(shù)量顯著減少（P＜0.001）；與ATRA 組比較，ATRA+Lv?sFlt?1 組細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞血管成管數(shù)量顯著減少（P＜0.001）。

圖7 各組細(xì)胞的促血管形成能力比較（×100）Fig.7 Comparison of the angiogenesis ability of the cells in each group（×100）

3 討論

ATRA 是維生素A 在體內(nèi)的重要活性代謝產(chǎn)物，在胚胎發(fā)育、組織器官形成、細(xì)胞增殖、分化、代謝及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮重要作用［7?9］，但過量的ATRA 會導(dǎo)致胎兒畸形，包括消化道畸形、先天性馬蹄內(nèi)翻足等。有研究顯示［6］，ATRA 在子癇前期患者子宮脫膜組織中含量較低，采用ATRA干預(yù)可導(dǎo)致子癇前期胎盤基底脫膜細(xì)胞中sFlt?1低表達(dá)，而采用ATRA 拮抗劑BMS493 干預(yù)可上調(diào)sFlt?1 表達(dá)，推測ATRA 有可能通過抑制sFlt?1 表達(dá)改善子癇前期胎盤血管發(fā)育異常。本研究結(jié)果顯示，ATRA 可能通過抑制sFlt?1 的表達(dá)促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和血管生成，從而可能影響子癇前期的病理過程。

sFlt?1 是血管內(nèi)皮生長因子受體?1（Flt?1）的稀有剪接形式，可與Flt?1 競爭性結(jié)合VEGF 和PIGF，使VEGF 和PIGF 生物學(xué)功能被抑制，造成胎盤血管生成障礙［10-11］。有研究利用不同藥物抑制sFlt?1水平達(dá)到了治療子癇前期的目的，例如硫酸鎂［12］、拉貝洛爾［13］、烏拉地爾和香丹注射液［14］等。本研究中首先采用ATRA 處理HTR?8/SVneo 細(xì)胞不同時間，發(fā)現(xiàn)ATRA 可抑制HTR?8/SVneo 細(xì)胞sFlt?1 mRNA 的表達(dá)及其蛋白的分泌，且呈時間依賴性，由此推測ATRA 可能抑制sFlt?1 表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，ATRA 處理可抑制HTR?8/SVneo 細(xì)胞分泌sFlt?1 蛋白，促進(jìn)PIGF 和VEGF 蛋白分泌，同時可提高細(xì)胞的侵襲、遷移以及促血管形成能力；而sFlt?1 過表達(dá)可促進(jìn)HTR?8/SVneo 細(xì)胞分泌sFlt?1 蛋白，抑制PIGF 和VEGF 蛋白分泌，并降低細(xì)胞促血管形成等能力；為了進(jìn)一步探討ATRA 通過抑制sFlt?1 表達(dá)而發(fā)揮作用，本研究采用ATRA 干預(yù)sFlt?1 過表達(dá)的HTR?8/SVneo 細(xì)胞，結(jié)果顯示sFlt?1 過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)ATRA 對HTR?8/SV?neo 細(xì)胞的干預(yù)效果，表明ATRA 是通過抑制sFlt?1表達(dá)，促進(jìn)PIGF 和VEGF 的分泌，進(jìn)而增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞促血管形成能力。此外，MMP?9 和MMP?2 是一類基質(zhì)金屬蛋白酶，表達(dá)異常可影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，導(dǎo)致血管重鑄不全［15］。研究表明［16-17］，子癇前期患者胎盤組織中MMP?2 和MMP?9 蛋白表達(dá)水平顯著降低。本研究結(jié)果顯示，ATRA 處理可促進(jìn)HTR?8/SVneo 細(xì)胞中MMP?9 和MMP?2 蛋白表達(dá)，而sFlt?1 過表達(dá)可顯著下調(diào)MMP?9 和MMP?2 蛋白表達(dá)水平；然而，sFlt?1 過表達(dá)又可抑制ATRA 干預(yù)對HTR?8/SVneo 細(xì)胞中MMP?9 和MMP?2 蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。因此，ATRA 可能通過抑制sFlt?1表達(dá)，促進(jìn)MMP9 和MMP2 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提高滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲與遷移能力。

綜上所述，ATRA 可能通過抑制sFlt?1 調(diào)控PIGF 和VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲及促血管形成能力，因而ATRA 可能具有改善子癇前期的效果。本研究的新穎之處是首次探討了ATRA對滋養(yǎng)細(xì)胞sFlt?1表達(dá)以及對其侵襲和促血管形成能力的影響，但不足之處是未在動物水平進(jìn)行驗證，因此下一步的研究方向?qū)M(jìn)行動物體內(nèi)探究。