HLA DRB1?0901多態性與常見過敏原致過敏反應易感性的關系

周道平 區宇潔 薛曉芳 郭菁 甄英鵬 陸偉桃 張玲 莫桂玲

1廣州開發區醫院（廣州510730）；2廣州金域醫學檢驗中心有限公司（廣州510320）

人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）?DRB1*0901 位點（ rs2395185）位于HLA?DRB1 的配體結合口袋，是與生物活性相關的氨基酸殘基。該位點已在多種疾病，如肺癌、淋巴瘤等的關聯分析研究中被報道［1?3］，并且，有報道rs2395185 與tIgE 水平升高［4］、系統性紅斑狼瘡的抗核抗體陽性相關［5］。因此，該位點可能與機體自身免疫相關。但是，該位點與中國人群過敏性皮膚病的關系未見報道。本研究探討rs2395185位點的多態性與廣州地區居民19 種皮膚過敏原的關系，為今后過敏相關皮膚疾病的個性化治療提供精準干預的理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年11月至2021年4月廣州開發區醫院、廣州市黃埔區紅十字會醫院皮膚科收治的過敏性皮膚病患者304 例，年齡2～81歲，平均年齡33.1 歲。其中男125 例，女179 例?；颊呔础吨袊R床皮膚病學》相關標準診斷并確診。患者的主要癥狀有蕁麻疹、濕疹等。所有受試者均為2 周內未用皮質類固醇激素和3 d 內停用抗組織胺藥的患者，排除合并慢性疾病或嚴重代謝性疾病、既往有皮膚病史的患者。受試者之間無直接親屬關系，本研究通過本院醫學倫理委員會批準，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 血液過敏原檢測 采集受試者外周血，分離血清1 mL，采用免疫印跡法檢測過敏原，包括19種過敏原：戶塵螨、屋塵、蟑螂、貓毛皮屑、狗毛皮屑、莧、混合草（肯塔基藍草/草地羊茅/果園草/小糠草/黑麥草/梯牧草/黃花茅）、桑樹、霉菌（點青霉/交鏈孢霉/煙曲霉/分枝孢霉）、樹花粉（櫟樹/榆樹/梧桐/柳樹/楊樹）、雞蛋白、牛奶、牛肉、蝦、蟹、貝、腰果、芒果、菠蘿，檢測儀器為phadia Immuno CAP250 過敏原檢測系統（瑞典法瑪西亞公司），檢測試劑為過敏原特異性抗體IgE 檢測試劑盒UniCAP（瑞典法瑪西亞公司）。檢測結果分為6級，0 級為不過敏（陰性），1 級為可疑或輕度過敏，2 級為輕度過敏，3 級為中度過敏，4 級為中到重度過敏，5 級以上為重度過敏。

1.3 HLA DRB1*0901（rs2395185）基因位點檢測 采用PCR 測序技術檢測外周血HLA DRB1*0901（rs2395185）基因位點。采集受試者外周靜脈血5 mL，置于EDTA?Na2 抗凝管中，?80 ℃冰箱保存。采用全血DNA 純化試劑盒HiPure FFPE DNA Kit（廣州美基生物科技有限公司）進行DNA 提取，操作步驟嚴格按照說明書進行。PCR 引物和測序引物委托蘇州泓迅生物科技股份有限公司進行合成，引物序列如下：PCR 上游引物0901?SNP?F1：5′?GTCCTGTGGCCCTCTGATATT?3′；PCR 下游引物0901?SNP?R1：5′?ATTGGATTGTTGGGGTTCACAAG?3′；測序引物：0901?SNP?SF：5′?TCCCTATTTCAA TAAGCAGCACCACC?3’。PCR 反應體系為：dNTP 2.5 μL，DNA 100 ng，0901?SNP?F1（10 μM）1 μL，0901?SNP?R1（10 μM）1 μL，2×Phanta Max Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）25 μL，ddH2O 補足到50 μL。PCR 條件為：預變性94 ℃3 min；變性94 ℃20 s，退火60 ℃20 s，延伸72 ℃30 s，35 個循環；72 ℃5 min；12 ℃保存。PCR 產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，按Gel Extraction Kit D2500 膠回收試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）說明書純化。純化的產物送測序公司進行測序鑒定rs2395185 基因型。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件。驗證HLA DRB1*0901（rs2395185）位點是否符合哈德?溫伯格平衡，采用直接計數法統計各位點的基因型頻率和等位基因頻率，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。計算顯性模型、隱形模型、累積模型（共顯型模型），方法如下：G 為野生型等位基因，顯性模型：G/G 加G/T 基因型人數與T/T 基因型人數比較；隱性模型：G/G 與G/T 加T/T 基因型人數比較；累積模型：G/G、G/T 及T/T 基因型人數三者比較。

2 結果

2.1 19 種過敏原陽性患者基因多態性檢測結果 304 例受試者中，rs2395185 G/G 基因型為150例（49.3%），G/T 基因型為128 例（42.1%），T/T 基因型為26 例（8.6%），最小基因頻率T＝0.296。19 種過敏原中任一種檢測陽性患者中，僅在戶塵螨、雞蛋白、混合草過敏原陽性患者中檢出T/T 基因型。各種過敏原陽性患者基因多態性檢測結果見表1。

表1 過敏原陽性患者rs2395185 基因多態性檢測結果Tab.1 Gene polymorphism of rs2395185 in patients with positive allergen例（%）

2.2 rs2395185 基因型與3 種過敏原檢測結果的關系分析 根據戶塵螨、雞蛋白、混合草3 種過敏原檢測結果是否陽性，把患者分成兩組，分析組間基因型分布及基因模型差異，結果見表2。rs2395185 位點基因型均符合哈德?溫伯格平衡（PHWE＞0.05）。將T/T 基因型設為對照，G/G 基因型、G/T 基因型在戶塵螨檢測陽性的患者中頻率均高于陰性患者，兩組間的基因型分布差異有統計學意義（P< 0.05），遺傳模型分析發現顯性遺傳模型（G/G+G/Tvs.T/T）差異有統計學意義（P<0.05），G 基因型可能與戶塵螨過敏相關；G/G、G/T基因型攜帶可能是戶塵螨過敏的危險因素（OR＝

表2 rs2395185 基因型與3 種過敏原檢測結果的關系分析Tab.2 Relationship between genotype of rs2395185 and three kinds of allergens例（%）

2.940，95%CI：1.167～7.407；OR＝2.889，95%CI：1.136～7.348）。而雞蛋白、混合草檢測陽性患者與陰性患者的G/G、G/T 基因型分布差異無統計學意義（P>0.05）。

2.3 rs2395185 基因型與過敏原反應嚴重程度的關系 將過敏原檢測結果分級為1、2 級的患者作為輕度過敏組，結果分級為3 級以上的患者作為中、重度過敏組，將T/T 基因型設為對照，G/T 基因型在兩組間的基因型分布差異有統計學意義（P＝0.027），G/T 基因型可能是過敏原反應嚴重程度的危險因素（OR＝8.681，95%CI：1.077～69.989）；遺傳模型分析發現隱性遺傳模型（G/Gvs.G/T+T/T）差異有統計學意義（P<0.01）。見表3。

表3 rs2395185 基因型與過敏原反應嚴重程度的關系Tab.3 Relationship between genotype of rs2395185 and severity of allergic reaction例（%）

3 討論

人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因群是調控人體特異性免疫應答、決定疾病易感性個體差異的主要基因系統［6］，HLA 分子肽結合槽是由等位基因編碼的，等位基因的多態性如果改變了結合槽的結構，HLA 分子肽和T 細胞的相互作用就會受到影響，從而控制了外源性及自身抗原免疫應答反應的特異性，使得不同的HLA 基因型對多種疾病的易感性不同［7?10］。

Ⅰ型超敏反應可引發過敏性疾病，與HLA?Ⅱ類基因多態性關系密切［11?13］。有學者認為HLA?Ⅱ類位點的基因可以調節環境中普通過敏原的IgE 免疫反應。研究表明HLA? DRB1* 0701 與TCR A/D 等位基因對于調節IgE 的產生有協同作用。最早研究HLA 基因多態性的報道認為DRB1*1501（DR2）相關的單倍型與豚草花粉所引起的過敏反應有關。另外，也有報道表明HLA?DR 和HLA?DQ 等位基因與花粉過敏、食物過敏的易感相關［14?15］。關于食物過敏，有研究認為HLA?DRB1*08、HLA?DRB1*08/12 tyr 16 和HLA?DQB1*04 基因型與花生過敏有明顯相關性［16?17］，HLA?DQ 基因的rs9271588 位點與小麥過敏有明顯相關性［18］。

HLA DRB1*09：01（rs2395185）位于HLA ?DRB1 的配體結合口袋，是與HLA?DRB1 生物活性相關的氨基酸殘基。該位點已在多種疾病的關聯分析研究中被報道。WANG 等［1］對肺癌發生風險SNP 的研究發現，HLA?DRB1*09：01 與APOBEC3A表達增加和APOBEC 突變率升高相關。WANG等［2］采用前瞻性隊列研究方法，探討日常烹飪時間與單核苷酸多態性（SNPs）對肺癌發病率的聯合影響，發現位于6p21.32 的rs2395185 和rs3817963與肺癌發病率顯著相關；與攜帶rs2395185GG 或rs3817963TT 基因型、不烹飪的受試者相比，每天烹飪時間超過2 小時且攜帶rs2395185GT+TT 基因型的受試者患肺癌的風險增加2.48 倍。另外，KENNEDY 等［3］在非西班牙裔白人男性中報道rs2395185 多態性與兒童淋巴瘤發病風險有強關聯。VINCE 等［4］在非洲人群中發現HLA?DRB1*09：01 與總IgE 水平升高相關。 TERAO 等［5］對于日本女性系統性紅斑狼瘡易感性的研究顯示，rs2395185 的T 等位基因與抗核抗體（ANA）陽性顯著相關。對于哮喘的全基因組關聯研究顯示rs2395185 的次要等位基因T 是哮喘的風險等位基因［19］，但也是潰瘍性結腸炎的保護性等位基因［20］。因此，筆者推測rs2395185 位點可能與機體自身免疫相關。但是，該位點與中國人群過敏反應發病風險的相關性未見報道。

本研究對于廣州地區居民的rs2395185 基因型進行了分析，結果表明，人群的最小等位基因頻率（T＝0.296）和1000Genomes、HapMap（T＝0.293）基本一致，但是與韓國人群（T＝0.378）、中東卡塔爾人群（T＝0.356）等有一定差異，說明該位點的多態性存在一定的種族差異。本次研究統計數據顯示，皮膚科就診患者陽性率最高的過敏原為戶塵螨、雞蛋白、樹花粉。對于皮膚科就診患者過敏原發病風險與rs2395185 基因型關系分析結果顯示，戶塵螨過敏原檢測結果陽性、陰性患者間rs2395185 的G/G 基因型、G/T 基因型分布差異具有統計學意義（P<0.05），與戶塵螨過敏的發病風險可能有關。對三種遺傳模型分析比較得出，G/G、G/T 基因型以顯性遺傳方式影響戶塵螨過敏（P＝0.015），存在G/G、G/T 基因型的患者戶塵螨過敏風險更高。而雞蛋白、混合草檢測陽性患者與陰性患者的G/G、G/T 基因型分布差異無統計學意義（P> 0.05），因此rs2395185 與這兩種過敏原所致的過敏反應發病風險可能不相關。另外，對rs2395185 基因型與過敏原反應嚴重程度關系進行分析，結果顯示輕度過敏與中重度過敏患者的G/T基因型在兩組間的基因型分布差異具有統計學意義（P< 0.05），G/T 基因型可能是過敏原反應嚴重程度的危險因素。

綜上所述，本研究在廣州地區居民中，對于HLA DRB1*09：01（rs2395185）位點與19 種常見過敏原所致的皮膚過敏反應的關系進行了研究，該位點多見于對肺癌等疾病的研究，在免疫相關疾病中少見報道。結果表明，廣州地區居民戶塵螨皮膚過敏發病風險可能與rs2395185 位點G/G、G/T多態性有關；19 種過敏原過敏的嚴重程度可能與rs2395185 位點G/T 多態性有關。本課題的局限性在于：樣本量有限，因此除了陽性率最高的戶塵螨、雞蛋白、樹花粉外，其他各種過敏原檢出的陽性病例較少、難以結合SNP 基因型進行分析；研究僅限于廣州地區；未能收集更詳細的臨床癥狀數據；除了年齡、性別外，未能收集到如職業接觸、生活環境等其他皮膚病相關致病因素的數據；未能檢測更多種類的過敏原。后續研究將收集更多不同地區、不同職業、接觸其他過敏原的人群樣本，以驗證該位點與皮膚過敏反應發生風險的關系是否具有地區及職業接觸差異、該位點與其他過敏原是否有關。