去甲斑蝥素誘導超氧陰離子的產生介導HeLa細胞線粒體途徑的細胞凋亡

董 秀，包 紅，韓兆豐

（1.遼寧中醫藥大學中西醫結合學院，沈陽 110847；2.遼寧中醫藥大學信息工程學院，沈陽 110847）

宮頸癌是危害女性健康的常見惡性腫瘤之一[1]。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是傳統中藥斑蝥的有效成分斑蝥素的低毒、高效衍生物，在臨床上已被用于輔助治療肝癌和食管癌等多種癌癥[2-3]。課題組前期研究發現去甲斑蝥素作用于人宮頸癌HeLa細胞后，激活內源性線粒體途徑誘導HeLa 細胞凋亡和G2/M 期細胞周期阻滯[4]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是氧化磷酸化的副產品，包括超氧陰離子（O2·-）、羥自由基（·OH）和某些非ROS 等[5]。細胞內生理水平的ROS 參與細胞信號轉導和調節生理進程，而過度產生的ROS 會引起細胞內生物大分子的損傷，造成氧化應激誘導細胞凋亡[6-7]。ROS 在藥物誘導腫瘤細胞凋亡過程中承擔重要作用，并且與線粒體途徑的細胞凋亡關系密切[8-9]。課題組前期研究發現，去甲斑蝥素作用于HeLa 細胞后，誘導主要以超氧陰離子形式存在的ROS 產生，并介導HeLa 細胞凋亡。本研究考察了去甲斑蝥素誘導超氧陰離子對人宮頸癌HeLa 細胞凋亡的作用及其機制。

1 材實驗料

CO2培養箱（美國Thermo 公司），熒光顯微鏡（德國 Leica Bensheim 公司），電泳槽（美國Bio-Rad 公司）。去甲斑蝥素購于美國Sigma Chemical公司（貨號：N8784），DMSO 溶解后，無菌條件下，用RPMI-1640培養液稀釋至所需濃度（DMSO ≤1‰）。人宮頸癌HeLa細胞（美國American Type Culture Collection（ATCC）公司），RPMI-1640 培養基購于美國Hyclone 公司，SOD（超氧化物歧化酶，超氧陰離子清除劑）購于（美國Sigma Chemical 公司），胎牛血清購于北京元亨圣馬生物技術研究所，ECL試劑盒購于美國Thermo公司，抗Bcl-2，Bax，β-actin 的一抗和羊抗鼠、羊抗兔二抗均購于美國Santa Cruz 公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 HeLa 細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 細胞培養液中，在37 ℃，5% CO2培養箱中培養。

2.2 PI 染色法檢測subG1 凋亡峰 將對數生長期的HeLa 細胞，按照每瓶1×106個細胞進行分瓶，培養箱中繼續培養24 h 后，加入 60 μmol/L 去甲斑蝥素作用細胞24 h 或用5 mmol/L SOD 預處理細胞1 h 后，再加入60 μmol/L 去甲斑蝥素作用24 h 后，加入胰酶消化后收集細胞，應用PBS 淋洗細胞2 次后，加入冰冷乙醇在4 ℃冰箱固定過夜。次日離心10 min 后棄去固定液，應用PBS 淋洗細胞2 次，加入含有PBS、PI 和RNA 酶的染色液1 mL，4 ℃冰箱避光冰浴1 h 后，流式細胞儀下進行分析，DNA 含量少于正常二倍體細胞的亞二倍體細胞比率計為凋亡比率。

2.3 線粒體膜電位的觀察 線粒體膜電位使用陽離子熒光染料羅丹明 123 進行檢測[10]。羅丹明 123 的熒光強度反映線粒體膜電位的高低。細胞培養和藥物處理同2.2。棄藥液后加入 1 μg/mL 羅丹明 123 染色15 min，并于 37 ℃ 孵育 30 min。棄上清，用 PBS 小心洗 1 次，消化離心，流式細胞儀進行熒光強度檢測?；蛟跓晒怙@微鏡下觀察細胞形態學變化并拍照。

2.4 免疫印跡法檢測蛋白表達 細胞培養和藥物處理同2.2，作用至指定時間后，收集貼壁細胞及懸浮細胞，進行蛋白印跡法分析。1 000 r/min 條件下，離心5 min，用PBS 洗2 次，加入裂解液，于4 ℃冰箱內冰浴 1 h 后，13 000×g 離心10 min，收集上清液。用Bio-Rad 法進行蛋白定量，蛋白變性后，每孔上樣20 μL。用12% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質。電泳后將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉后，用相應抗體檢測蛋白，一抗室溫搖床孵育2 h，放入4 ℃冰箱過夜，次日TBST 洗膜3 次，每次10 min。以辣根過氧化酶標記的二抗封閉液室溫搖床孵育2 h，TBST 洗膜3 次。加入ECL 顯色，然后采用凝膠成像系統拍照，測定目的蛋白和內參條帶的光密度值，計算目的蛋白和內參的光密度比值，進行統計分析。

2.5 統計學分析 實驗結果采用SPSS 22.0 統計學軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差（）表示。各組間數據比較應用單因素方差分析。

3 實驗結果

3.1 抑制超氧陰離子的產生對去甲斑蝥素誘導的細胞凋亡的影響 PI 染色后檢測發現，與對照組相比，流式細胞檢測結果表明去甲斑蝥素作用24 h 明顯增強了subG1 凋亡峰（從1.49%上升至18.74%，P＜0.05）；與去甲斑蝥素作用組比較，SOD 預處理清除超氧陰離子的產生能明顯降低subG1 峰值（SOD 加 NCTD 組：4.73% vs.NCTD 組：18.74%，P＜0.05）（圖 1）。

圖1 去甲斑蝥素誘導HeLa 細胞凋亡

3.2 抑制超氧陰離子的產生逆轉了去甲斑蝥素誘導的線粒體膜電位崩潰 使用羅丹明123 染色法評估細胞線粒體膜電位的變化。流式細胞儀分析檢測和熒光顯微鏡形態學觀察結果顯示，與對照組細胞相比，去甲斑蝥素作用24 h 后明顯導致線粒體膜電位的喪失，而用SOD 預處理細胞清除超氧陰離子的產生后，完全逆轉了去甲斑蝥素誘導的線粒體膜電位的崩潰（圖2）。

圖2 去甲斑蝥素對線粒體膜電位的影響

3.3 抑制超氧陰離子的產生對線粒體途徑相關凋亡蛋白表達的影響 實驗結果表明，與對照組相比，去甲斑蝥素作用24 h 后，Bcl-2 表達量明顯下降，Bax 的表達量增加。為了明確超氧陰離子的產生與這些蛋白表達的關系，我們用SOD 預處理細胞清除超氧陰離子的產生，然后加入去甲斑蝥素作用24 h。結果顯示，SOD 的加入可以明顯逆轉去甲斑蝥素單獨作用引起的Bax 和Bcl-2 蛋白表達的變化（圖3）。

圖3 去甲斑蝥素對細胞凋亡相關蛋白表達的影響

4 討論

去甲斑蝥素是我國自行研制的中藥斑蝥有效成分斑蝥素的衍生物，對乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌等婦科腫瘤有抗癌作用[11-12]。宮頸癌屬于中醫婦科積聚類疾病范疇，其發病與氣滯血瘀相關[13]。因此，去甲斑蝥素輔助治療宮頸癌有較好的療效，但其抗癌機制尚未明確，仍然值得深入研究。

眾多的研究表明，在一些腫瘤細胞系中誘導ROS的生成是抗腫瘤藥物發揮其作用的重要手段[14-16]。我們在研究中發現去甲斑蝥素誘導的ROS 主要以超氧陰離子的形式存在，為了明確超氧陰離子的產生在去甲斑蝥素調控HeLa 細胞凋亡中的作用，應用超氧陰離子清除劑SOD 清除超氧陰離子的產生，然后用PI 染色法檢測細胞凋亡率。實驗結果顯示，去甲斑蝥素作用24 h 后明顯增強了HeLa 細胞凋亡率，而SOD 預處理后明顯降低了去甲斑蝥素誘導的細胞凋亡率，提示超氧陰離子在去甲斑蝥素誘導的HeLa 細胞凋亡中發揮關鍵作用。

在體內，ROS 的產生和清除在生理情況下處于動態平衡，因此大量的ROS 產生將破壞抗氧化體系的動態平衡，造成氧化應激，導致DNA 損傷，線粒體功能障礙，最終引發內源性凋亡途徑誘導細胞死亡[17]。同時，ROS 的爆發總是伴隨著線粒體PT 孔開放并進一步誘導線粒體膜電位的崩潰，最終誘發細胞凋亡[18]。我們采用羅丹明123 染色法檢測細胞線粒體膜電位完整性，實驗結果顯示去甲斑蝥素作用24 h 后明顯導致線粒體膜電位的喪失，而用SOD 預處理后能夠完全逆轉去甲斑蝥素誘導的線粒體膜電位的崩潰。以上結果提示，去甲斑蝥素增加超氧陰離子的產生導致線粒體功能障礙及誘導線粒體膜電位的喪失。

線粒體與細胞凋亡的發生關系密切。當線粒體途徑的細胞凋亡發生時，會出現Bax 表達增加，Bcl-2 表達降低，兩者的比率失衡將進一步加劇線粒體膜電位的崩潰[19]。實驗中發現，去甲斑蝥素誘導了線粒體膜電位的下降，Bcl-2 的水平降低，Bax 的表達增加。但加入SOD 清除超氧陰離子的產生后可抑制去甲斑蝥素誘導的膜電位的下降，Bcl-2 的水平降低，Bax 的表達增加這些變化，表明超氧陰離子是去甲斑蝥素誘導HeLa 細胞發生凋亡的主要原因。