“人參-黃連”藥對成分分析及對α-葡萄糖苷酶的影響

李春楠，張凱月，杜延佳，呂金鵬，楊小倩，張 輝*

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.吉林省東北亞生物科技有限公司，長春 130117）

人參黃連藥對出自《萬病回春》中“參連飲”，具有益氣生津，清熱燥濕的功效，是中醫治療“消渴癥”古方中清熱益氣藥的代表。人參具有補氣固脫，健脾益肺，寧心益智，養血生津的作用，在張仲景的《傷寒雜病論》中對人參已有記載“白虎加人參治療消渴”；而《本草綱目》對黃連有記載“治消渴”用“酒蒸黃連”，證明黃連可治療消渴癥。現代藥理研究證實，人參黃連配伍能夠調節空腹血糖、血胰島素，改善胰島素抵抗，被廣泛地應用于糖尿病的臨床治療[1]。另外，人參-黃連藥對配伍，其降糖作用要高于單味中藥的降血糖活性作用[2]。中藥具有多成分、多活性作用的多樣性特點，其多個配伍在疾病治療上具有其獨特的優勢。

中醫學范疇的“消渴病”即是現代所指的糖尿病，是由胰島素抵抗、胰島素相對或絕對不足引起的內分泌代謝紊亂，并最終導致血糖升高和并發癥的發生[3]。人參、黃連及其藥對是治療糖尿病的代表性中藥，運用廣泛且效果顯著，毒副作用少，不過其活性成分并不十分清楚，本研究應用HPLC-MS 技術及α-葡萄糖苷酶對人參、黃連進行成分活性研究，為人參黃連藥對的臨床應用及相關藥品研發提供參考依據。

1 儀器與試藥

安捷倫1100 液相色譜儀；美國Agilent 6320 離子阱LC/MS，該系統配有G1315B 二極管陣列檢測器；KH-250DB 型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；全自動酶標記儀(BIO-RAD-680)；MS204S 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rf、人參皂苷Re、小檗堿的標準品購自上海源葉生物有限公司；100U α-葡萄糖苷酶（Sigma 公司）；人參、黃連分別采自吉林和內蒙古，經長春中醫藥大學張輝教授鑒定分別為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Meyer 的干燥根，毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.根莖；乙腈（Fisher）、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水是娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 供試品制備 取人參粉末，甲醇30 mL 超聲30 min，過濾，取續濾液，水浴蒸干，加水使溶解，水飽和正丁醇萃取3 次，合并正丁醇液，蒸干，加甲醇10 mL 使溶解，大孔吸附樹脂上樣，待樣品液面與大孔樹脂相水平后，100 mL 70%乙醇洗脫，續濾液蒸干，30 mL 甲醇溶解，即得；黃連藥材粉末，加50%乙腈-鹽酸（100:1）50 mL，超聲處理30 min，用50%乙腈-鹽酸（100:1）補足失去的重量，精密稱取2 mL 溶液，置10 mL 的容量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.2 HPLC-MS 檢測條件 質譜條件：電噴霧源參數設置氣體溫度為350℃；毛細管電壓為4000 伏；噴霧器壓力為35 psi；干燥氣體為9.0 L/min；撇油器電壓為60 V；鞘氣和輔助氣體為氮氣；掃描范圍為50～1 200 m/z。

人參皂苷的色譜條件：Agilent EC-C18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動相由乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脫：0～5 min，19%→30% A；5～25 min，30%→40% A；25～40 min，40%→90% A；40～46 min，90%→95% A；流速為0.8 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長為203 nm；進樣量為10 μL。黃連生物堿色譜條件：Agilent Xcharge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.25 mol/L 乙酸銨和8 mmol/L 十二烷基硫酸鈉（SDS）水溶液（氨水調節pH 為9.3）（B），洗脫40 min，40% A；柱溫30 ℃；流速為1 mL/min；檢測波長為270 nm；進樣量為8 μL。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 根據參考文獻[4-5]，方法略作變動，實驗分為空白組、樣品組和陽性對照組，一次加入PBS 緩沖液、樣品和0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶，在37 ℃搖床中孵育15 min 后，加入PNPG（5 mmol/L）底物溶液，孵育20 min，加入0.2 mol/L Na2CO3終止反應，405 nm 處測定吸光度，抑制率計算公式為Inhibitory rate=（A0-A1）/（A0-AB）A0、A1 和AB 分別是對照、樣品和空白的吸光度。

3 結果

3.1 HPLC-MS 分析結果 用高效液相色譜-電噴霧質譜聯用儀對人參、黃連提取物進行分析，并與標準化合物的峰進行了比較，通過比較保留時間、質譜數據、MS2 數據，鑒定出11 種化合物，HPLC 圖譜見圖1，高效液相色譜—電噴霧質譜數據如表1 所示。

表1 HPLC-ESI-MS 數據結果

圖1 人參（A）、黃連（B）的液相色譜圖

3.2 方法學考察結果 取標準品溶液，連續 6 次進樣，結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、鹽酸小檗堿的RSD為 1.2%、0.9%、1.3%和 1.6%（n=6），說明該儀器的精密度較好；分別取等量供試品5 份，分別進樣4 化學成分的 RSD 在 1.5%～2.1%，說明方法重現性良好；取人參、黃連供試品溶液1 份，分別在0、2、4、8、16、24 h 后進樣，結果化合物RSD 在0.8%～2.4%，說明樣品在制備24 h 內穩定性良好；分別稱取供試品配制成最終濃度1 mg/mL，分別精密加入一定量對照品，進樣測定，計算加樣回收率，結果加樣回收率（n=6）在97.15%-107.31%，RSD 在0.8%～2.8%之間，表明本方法回收率良好，具體線性關系結果見表2。

表2 主要化學成分線性關系

3.3 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性檢測 人參皂苷和生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制活性 我們進一步研究了3 種人參皂甙和2 種生物堿在體外對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。阿卡波糖作為陽性對照藥物，其IC50=0.65 mg/mL，結果如表3 所示。

由表3 可知，鹽酸藥根堿和鹽酸小檗堿具有明顯的抑制作用，人參皂苷Rb1、人參皂苷Re 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用較差。通過以上研究，我們可以得出結論，人參皂苷和生物堿都是具有降糖作用的，但體外試驗表明生物堿是參連飲中對α-葡萄糖苷酶抑制作用較強的成分，可能人參皂苷通過增加胰島素分泌或體內其他機制具有更好的抗高血糖作用。

表3 人參皂苷和生物堿對α-葡萄糖苷酶抑制作用

4 討論

本研究采用高效液相色譜—質譜聯用技術鑒定了參連飲中人參、黃連當中主要成分人參皂苷和生物堿，結果證明一些人參皂苷成分、生物堿在體外α-葡萄糖苷酶有顯著的抑制作用，通過HPLC-MS 對中藥活性成分的鑒定和檢測為該藥對在臨床應用提供了一些實驗參考數據，本研究采用高效液相色譜—二極管陣列檢測器方法，建立了檢測人參皂苷和生物堿的分析方法。實驗結果表明，該方法能夠全面檢測出人參、黃連主要成分，體外α-葡萄糖苷酶抑制試驗可能無法通過其抗高血糖特性充分反映體內成分的作用及其對人體的健康促進特性，因此需要對其生物活性進行進一步的細胞和體內研究。這些結果表明，綜合分析該方劑的化學成分和藥理活性，有助于揭示其在臨床應用中的可行性和可靠性。