逍遙散對慢性束縛應激肝郁脾虛證大鼠MMP2、TIMP2表達的影響?

秦生發， 張 錚， 藍敏敏， 李熠毅， 常曉威， 韋俊彬， 李曉紅,2△， 楊力強,2△

(1.廣西中醫藥大學， 南寧 530200；2.廣西中醫藥大學廣西中醫基礎研究重點實驗室， 南寧 530200)

肝郁脾虛證是指肝失疏泄，脾失健運，以胸脅脹痛、腹脹、便溏、情志抑郁癥狀為主要表現的證候，在臨床涉及諸多疾病，是情志相關疾病的主要臨床證型之一[1]，應激事件能誘發肝郁脾虛證或加重肝郁脾虛證患者的臨床表現。研究表明，肝郁脾虛病理機制與腦-腸軸學說和腦腸互動理論異曲同工[2]。逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，由柴胡、白術、白芍、當歸、茯苓、甘草、薄荷、燒生姜8 味藥物組成，對防治應激性疾病及肝郁脾虛證具有良好的療效[3-4]。課題組長期的研究表明，慢性應激肝郁脾虛證大鼠存在腦腸軸功能紊亂與腦腸互動功能障礙[5-8]，具有下丘腦、胃組織差異表達基因組學背景[9-10]；而逍遙散能夠拮抗慢性應激肝郁脾虛證大鼠HPA軸功能亢進，緩解大鼠的抑郁表現[11]，通過雙向調節腦腸軸上多種神經肽的異常表達，從而改善肝郁脾虛證大鼠的腦腸互動功能障礙[5-8]，參與神經-內分泌-免疫網絡的整合功能，發揮其抗應激作用[12]。課題組前期在慢性束縛應激誘導的肝郁脾虛證大鼠下丘腦、胃、結腸組織的基因表達譜實驗中發現，肝郁脾虛證大鼠體內眾多與腫瘤相關的基因發生了變化，在后續的研究中選擇與腫瘤發生發展密切相關的基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)、基質金屬蛋白酶組織抑制劑2(matrix metalloproteinase tissue inhibitor 2，TIMP2)2個指標，檢測其在血清中的含量以及胃組織中基因和蛋白表達變化，并觀察了逍遙散的調節作用，現報道如下。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠75只，6～7周齡，體質量(200±20)g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，動物許可證號SCXK(桂)2009-0002，動物倫理審查編號DW20190111-009。動物飼養于廣西中醫藥大學動物實驗中心普通級動物房，光照節律 12 L∶12 D，喂飼常規飼料及飲用水，室溫20～22 ℃，相對濕度為50%～60%。

1.2 藥物與試劑

逍遙散組成：柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓各30 g，炙甘草15 g，燒生姜10 g，薄荷(后下)10 g，制成濃度1.67 g/mL的溶液。中藥飲片購自廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，經廣西中醫藥大學藥學院滕建北教授鑒定藥品質量合格。Rat MMP2、TIMP2 ELISA試劑盒(基因美公司，貨號分別為JYM0522Ra、JYM0505Ra)；MMP2原位雜交試劑盒(武漢博士德生物有限公司，貨號00464041-124080ETC)；逆轉錄試劑盒(TAKARA公司，貨號639505)；YBR Green PCR 試劑盒(KAPA Biosystems公司，貨號KM4101)；MMP2、TIMP2抗體(Bioswamp公司，貨號分別為PAB30618、PAB32556)，GAPDH 抗體(Bioswamp公司，貨號PAB36269)。

1.3 儀器

GE48527型PCR儀(杭州柏恒科技有限公司)；CFX-Connect 96型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)；DNM-9602型酶標儀(北京普朗新技術有限公司)；mini protean 3 cell型電泳儀(美國Bio-Rad)；Tanon-5200型全自動化學發光分析儀(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥

75只雄性SD大鼠適應性飼養5 d后，采用隨機數字表法分為正常組、7 d模型組、7 d逍遙散組、21 d模型組、21 d逍遙散組每組各15只。采用慢性束縛應激結合孤養方法造模[5,11]，除正常組以外的各組大鼠均用束縛架進行捆綁束縛，每日于18∶00～6∶00點束縛3 h，束縛時間點隨機，7 d模型組和7 d逍遙散組捆綁束縛7 d，21 d模型組和21 d逍遙散組捆綁束縛21 d；從造模第 1天開始，每日在捆綁前30 min給各組大鼠灌胃，逍遙散組大鼠灌服逍遙散中藥煎液，根據成人逍遙散每日用量，按體表面積換算成大鼠用藥量為16.7 g/(kg·d)，灌胃容積為 1 mL/100 g 體質量，每日1次，連續7 d和21 d；正常組、模型組大鼠每日灌服同等換算量的生理鹽水，造模期間根據大鼠體質量調整給藥量。

2.2 取材

造模7 d和21 d結束后，各組大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射進行深度麻醉(0.4 mL/100 g 體質量)；剖開大鼠腹腔，腹主動脈取血，分離血清至1.5 mL離心管中；取血后切取全胃，用預冷的0.9%氯化鈉溶液徹底沖洗干凈，取胃體中部上1/3約0.3 cm×0.5 cm的胃組織，置凍存管中迅速放入液氮速凍，取材完畢將標本放入-80 ℃冰箱保存，用于熒光定量 PCR和Western blot實驗；用于原位雜交實驗的胃組織取胃體中部上 1/3 約 1 cm×1 cm的小塊組織放入 4%多聚甲醛固定液中4 ℃固定。固定后取出胃組織標本進行洗滌、脫水、 透明、浸蠟，石蠟包埋。

2.3 指標檢測

2.3.1 ELISA檢測血清MMP2、TIMP2含量 采用ELISA法檢測血清MMP2、TIMP2含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.3.2 實時熒光定量PCR檢測胃組織 MMP2、TIMP2基因表達 使用Trizol 法從胃組織中提取總RNA，微量核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度、純度及完整性；將 RNA反轉錄合成cDNA；PCR擴增采用20μL反應體系：SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板加樣1 μL，加水至總體積為20 μL。反應程序按試劑盒說明書進行。PCR引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，GAPDH(F：5’-CAAGTTCAACGGCACAG-3’，R：5’-CCAGTAGACTCCACGACAT-3’，產物長度138bp)，MMP2(F：5’-TGGAAGCATCAAATCGGAC TG-3’，R：5’-GGAGGGCTGCATTGTGAATATC-3’，產物長度290bp)，TIMP2(F：5’-GGCGGAAGGA GATGGCAAGATG-3’，R：5’-AGTCCATCCAGAGG CACTCATCC-3’，產物長度185bp)。采用2-△△Ct來計算MMP2、TIMP2 mRNA的相對表達量。

2.3.3 Western Blot法檢測胃組織MMP2、TIMP2蛋白表達 將大鼠胃組織剪碎，每20 mg組織加入250 μL裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)勻漿至完全裂解，在4 ℃、12000×g離心15 min取上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒蛋白定量后貯存于- 80 ℃冰箱。根據目的蛋白的分子量大小配制6%的分離膠和5%的濃縮膠，取含有20 μg 總蛋白的組織裂解產物進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉印至PVDF膜上，將膜放入5%的脫脂奶粉中室溫封閉2 h，孵育一抗，MMP2的稀釋度均為 1∶2000,TIMP2、GAPDH的稀釋度為1∶1000，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入辣根酶標記的二抗(1:10000)，室溫孵育1 h，用PBST洗滌3次。最后通過Tanon-5200成像系統進行ECL化學發光檢測，TANON GIS 軟件讀取各條帶灰度值。以 GAPDH 為內參，檢測目的蛋白MMP2、TIMP2的蛋白表達情況。

2.3.4 原位雜交檢測胃組織MMP2 mRNA表達 實驗步驟按照試劑盒說明書操作，具體檢測步驟：切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后，用3% H202滅活內源性過氧化物酶；滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶以暴露mRNA核酸片段；滴加不含探針的預雜交液，42 ℃預雜交2 h；滴加含探針的雜交液，42 ℃雜交過夜(用PBS代替探針雜交液作為陰性對照)；滴加血清封閉液；滴加SABC進行孵育后，再滴加生物素化過氧化酶進行孵育，并用DAB顯色、蘇木素復染；脫水透明、封片、觀察，應用Image-proPlus 6.0圖像分析系統進行圖像分析，每組測試9張切片，分析每張切片的陽性面積和積分光密度(intergral optical density，IOD)，以IOD表示mRNA的相對含量。MMP2探針序列：5’-TTCTA TGGCT GCCCC AAGGA GAGCT GCAAC-3’；5’-GACAG CCCTG CAAGT TTCCA TTCCG CTTCC-3’；5’-GAACC AAAGT CTGAA GTGCG TGAAG TTTGG-3’。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠血清MMP2、TIMP2含量結果

表1示，與正常組比較，7 d、21 d模型組大鼠MMP2含量均顯著升高(P<0.01)，TIMP2含量均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，其中7 d模型組大鼠MMP2升高更明顯，TIMP2降低更明顯；逍遙散能明顯降低模型大鼠MMP2含量，升高TIMP2含量(P<0.05)。

表1 各組大鼠血清MMP2、TIMP2含量比較

3.2 各組大鼠胃組織實時熒光定量 PCR檢測MMP2、TIMP2mRNA表達結果

表2示，與正常組比較，7 d和21 d模型組大鼠胃組織MMP2 mRNA表達顯著升高(P<0.01)，TIMP2 mRNA表達顯著降低(P<0.01)，逍遙散可明顯下調胃組織MMP2mRNA表達(P<0.01)，上調TIMP2 mRNA表達(P<0.01)。

表2 各組大鼠胃組織MMP2、TIMP2 mRNA表達比較

3.3 各組大鼠胃組織Westernblot檢測MMP2、TIMP2蛋白表達結果

圖1表3示，模型組胃組織MMP2和TIMP2的蛋白表達趨勢不同，MMP2表達明顯升高，TIMP2表達明顯降低，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；逍遙散能降低MMP2表達，升高TIMP2表達，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

注：a正常組; b. 7 d模型組; c. 7 d逍遙散組; d. 21 d模型組; e.21 d逍遙散組；基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)，基質金屬蛋白酶組織抑制劑2(matrix metalloproteinase tissue inhibitor 2，TIMP2)

表3 各組大鼠胃組織MMP2、TIMP2 蛋白表達比較

3.4 各組大鼠胃組織原位雜交檢測MMP2 mRNA表達結果

圖2表4示，MMP2雜交陽性反應物在細胞胞漿著色呈棕黃色，與正常組比較，7 d和21 d模型組大鼠胃組織MMP2 mRNA表達的陽性面積和積分光密度均顯著增加(P<0.01)，說明逍遙散能逆轉MMP2的異常表達(P<0.05，P<0.01)。

表4 各組大鼠胃組織MMP2 mRNA表達陽性面積和IOD值比較

注：基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)

4 討論

應激是機體受到各種內外環境因素刺激時所出現的非特異性全身反應。以往的研究論證，由慢性束縛應激誘導的21 d大鼠模型為肝郁脾虛證大鼠模型，慢性束縛應激7 d大鼠處于急性應激期，束縛時反抗、嘶叫，這一階段符合“肝郁證”表現；7 d后逐步適應，反抗、嘶叫逐漸減少，由急性應激期向慢性應激期轉化；14 d后進入慢性應激期，應激大鼠神態倦怠、煩躁、大便稀軟等癥狀逐漸加重，肝郁日久，木郁乘土，形成“肝郁脾虛證”表現[13]。以往的研究也表明，長期的慢性應激可以誘發和調控腫瘤的發生發展[14]。

腫瘤是由腫瘤細胞、多種基質細胞以及細胞外基質構成的有機體。腫瘤細胞的發生與轉移依賴于周圍的微環境，“腫瘤微環境”主要由細胞外基質(extracellular matrix，ECM)、成纖維細胞、血管/淋巴管和免疫細胞組成，它們與腫瘤細胞相互作用，共同促進腫瘤的生長與轉移。以往研究表明，腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移常常伴有ECM的變化及腫瘤血管的形成，最終形成適合腫瘤細胞生存的微環境。ECM由基底膜(basement membrane，BM)和細胞間質組成，為腫瘤轉移的重要組織屏障。腫瘤血管是腫瘤生長和轉移的形態學基礎，惡性腫瘤的生長、浸潤和轉移依賴于新生血管的生成，新生血管的數目與臨床預后有一定的關系。ECM降解是腫瘤新生血管生成、腫瘤細胞侵襲和轉移的必要條件，BM的完整與否是腫瘤組織新生血管生成過程中的關鍵因素。因此，腫瘤細胞自身或刺激宿主細胞分泌多種蛋白水解酶影響BM和ECM的降解，在腫瘤浸潤和轉移的過程中是重要環節。而在此環節中，基質金屬蛋白酶(MMPs)及基質金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPs)的動態平衡起到關鍵作用。

MMPs 是一類由多種細胞分泌并能夠裂解大分子細胞外基質的肽鏈內切酶,在腫瘤的發生、浸潤與轉移中起重要作用。TIMPs是一組能特異性抑制MMPs活性的多功能生物因子，可負性調節基底膜降解過程，在ECM的重塑過程中起決定作用。目前為止，已經發現的MMPs 家族成員至少有26種，TIMPs家族成員有TIMP1～4種。MMP2是MMPs的重要成員，MMP2的催化域中含有膠原結合區域，能特異性地降解BM和ECM的主要成分Ⅳ型膠原。因此，MMP2的作用與基質重建密切相關，如分解細胞外基質蛋白和細胞表面的分裂受體，特別是與癌細胞增殖有關的受體，影響腫瘤細胞的微環境。MMP2通過整合素參與血管生成，侵犯淋巴管及小血管，從而促進腫瘤的發生、侵襲與轉移。以往的研究表明，MMP2過度表達與人類包括胃癌在內的多種惡性腫瘤的發生、侵襲、轉移及預后密切相關[15，16]。TIMP2是TIMPs家族成員之一，是MMP2的內源性抑制劑，可優先與活化或非活化的MMP2結合，構成1∶1的復合物，發揮抑制MMP2的生理作用，參與組織損傷后修復和組織器官發育等過程[17]。TIMP2能夠特異性抑制MMP2的活性，從而減少ECM的降解，降低癌細胞的遷移能力[18]。正常情況下，TIMP2與MMP2 形成動態平衡，在調節ECM的穩態中有重要作用，二者間失衡可導致ECM降解，進而促進腫瘤血管的生成。Li等[19]的研究發現，TIMP2能明顯地抑制肺癌、結腸癌小鼠腫瘤的生成、血管生長和轉移，延長小鼠的存活期。

本次實驗結果顯示，大鼠應激7 d和21 d后血清MMP2含量、胃組織MMP2 mRNA和蛋白表達均顯著升高，TIMP2 的表達則顯著降低，逍遙散能顯著降低MMP2的表達，升高TIMP2的表達，表明7 d和21 d應激大鼠體內和胃組織出現了MMP2、TIMP2二者的平衡失調。而逍遙散可逆轉MMP2、TIMP2的異常表達，恢復二者的平衡，提示由慢性束縛應激誘導的肝郁脾虛證大鼠體內可能存在易罹患胃癌的風險，逍遙散可通過調節MMP2、TIMP2的異常表達，從而降低應激大鼠患癌的風險。以往的研究也表明，慢性應激可導致MMP2的表達異常[20]，慢性應激大鼠血清CEA、CA19-9、CA724、AFP等腫瘤標志物升高，逍遙散能夠有效降低慢性應激誘發的腫瘤標志物升高，有望預防慢性應激誘發的癌變[21]。臨床研究亦表明，逍遙散對腫瘤患者具有良好的治療作用[22]。

綜上所述，本研究檢測了MMP2、TIMP2在慢性束縛應激肝郁脾虛證大鼠血清中的含量及胃組織中的基因和蛋白表達變化，只是初步探索了胃癌發病風險，存在的不足之處是并未檢測應激大鼠體內腫瘤標志物的變化情況。在今后的研究中將對前期實驗進行補充完善，并進一步探索與腫瘤發生密切相關的病理機制，觀察慢性應激是否可以直接刺激腫瘤的發生。