左歸降糖解郁方對(duì)模擬糖尿病并發(fā)抑郁癥環(huán)境下海馬NVU結(jié)構(gòu)蛋白的作用及機(jī)制研究?

凌 佳， 柳 卓， 劉 檢， 朱 青， 韓遠(yuǎn)山， 趙洪慶， 孟 盼， 楊 蕙， 王宇紅△

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心， 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)研究院附屬醫(yī)院， 長(zhǎng)沙 410006；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 長(zhǎng)沙 410007；4.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院， 長(zhǎng)沙 410007)

糖尿病并發(fā)抑郁癥(diabetes mellitus with depression,DD)是糖尿病患者常見的以認(rèn)知功能障礙為主要特征表現(xiàn)的慢性并發(fā)癥。據(jù)報(bào)道，60%～75%糖尿病患者有抑郁情緒[1]，且DD患者的死亡率明顯高于單純糖尿病患者[2]，因此開展DD的發(fā)病機(jī)制及防治應(yīng)用研究很有意義。神經(jīng)血管單元(neurovascular unit，NVU)主要包含微血管、周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞及其突起的周圍神經(jīng)元等部分[3-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，DD大鼠血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)相關(guān)蛋白表達(dá)下降，提示BBB損傷[5]，在此基礎(chǔ)上推測(cè)NVU結(jié)構(gòu)也可能受損。膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、間隙連接蛋白-43(connexin-43, CX43)和緊密連接蛋白(occluding)分別是星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白，星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間、星形膠質(zhì)細(xì)胞與微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接通道。故本研究建立神經(jīng)元(neuron,NE)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astroglia，AS)、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(The brain microvascular endothelial cells,BMECs)三細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系，采用高糖聯(lián)合皮質(zhì)酮模擬DD環(huán)境，擬從NVU角度探討左歸降糖解郁方對(duì)模擬DD環(huán)境下GFAP、CX43及occluding的影響，并初步探討中藥復(fù)方對(duì)DD大鼠海馬NVU的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 藥物

左歸降糖解郁方(以下簡(jiǎn)稱左歸方)組成：黃芪、牛膝、山茱萸、枸杞子、丹參、熟地黃、菟絲子、姜黃、杜仲、牡丹皮、貫葉金絲桃，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并按比例水煎濃縮后制成口服液。鹽酸二甲雙胍片(吉林省東北亞藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H22020508，0.25 g/片)；鹽酸氟西汀(西南藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20160029，20 mg/片)。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，其中新生1 d和10 d的乳鼠各5只，雌性成年大鼠(受孕18 d)3只(400～450 g)，9只雄性成年大鼠(200～220 g)，均購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2015-0003。AS原代取材于1 d新生乳鼠中。BMECs原代取材于10 d新生乳鼠，海馬NE原代取材于受孕雌性大鼠。雄性實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，溫度(25±5)℃，濕度40%。

1.3 試劑

皮質(zhì)酮(Sigma，貨號(hào)CCAD300161)、L-多聚賴氨酸(Sigma，貨號(hào)25988-63-0)、DMSO(Sigma，貨號(hào)67-68-5)；Ⅰ型膠原酶(Amresco，貨號(hào)C0130)，兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(nerve-specific enolase，NSE)多克隆抗體(Bioworld，貨號(hào)6813-50)；兔抗大鼠GFAP抗體、DAPI(Abcam，貨號(hào)ab218309、ab104139)；兔抗大鼠occluding抗體(Proteintech，貨號(hào)13409-1-AP)、兔抗大鼠CX43抗體(Proteintech，貨號(hào)15386-1-AP)、小鼠抗大鼠GAPDH抗體(Proteintech，貨號(hào)10494-1-AP)。

1.4 儀器

ABI3500型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)(PerkinElmer)；3422，3412，3450，3460型Transwell小室(Corning)；Galaxy 48 R型三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱(Eppendorf)；GR-60DA/GR型高壓蒸汽滅菌鍋(Zealway)；6406型體視顯微鏡(Leica)。

2 方法

2.1 海馬NVU模型的建立

2.1.1 NE、As及BMECs原代培養(yǎng)及鑒定

(1)NE原代培養(yǎng)及鑒定：10 %水合氯醛腹腔麻醉18 d 受孕SD大鼠，取胎鼠全腦中海馬，剪碎后加0.25%胰蛋白酶和0.2%膠原酶(1：1)混合液消化、離心、重懸、過篩、計(jì)數(shù)，6 × 104/孔接種于96孔培養(yǎng)板(預(yù)包被)，4 h后全量換成維持液(Neurobassal：B27補(bǔ)充劑：Glutamax：雙抗=96∶2：1∶1)，第3天半量更換維持液。待NE生長(zhǎng)5 d后，室溫固定30 min，0.25% TritonX-100孵育，30 min封閉(5% BSA)，滴加兔抗大鼠NSE，4 ℃過夜；加FITC標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h，加DAPI室溫20 min，50 μL PBS，Operetta型高內(nèi)涵成像分析(high content analysis，HCA)系統(tǒng)觀察、拍照并分析。

(2)As原代培養(yǎng)及鑒定：將新生3 d乳鼠脫臼處死后無菌取出大腦，去血管和腦膜保留皮質(zhì)，剪碎、消化、離心、重懸、過篩、計(jì)數(shù)，5×105/瓶接種至預(yù)包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中，30 min后轉(zhuǎn)移上清培養(yǎng)液至另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d換液1次，振蕩棄除脫落細(xì)胞，正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)即可。培養(yǎng)2代后將細(xì)胞混懸液接種到96孔培養(yǎng)板中(5×105/mL)，待細(xì)胞生長(zhǎng)基本融合后，根據(jù)上述操作，以GFAP抗體和DAPI作為標(biāo)記，采用HCA系統(tǒng)觀察分析。

(3)BMECs：原代培養(yǎng)及鑒定：根據(jù)上法取出新生10 d乳鼠大腦皮質(zhì)，離心后棄上清；在沉淀的組織中等量加入25% 牛血清白蛋白后反復(fù)吹懸，離心2次，將所得血管沉淀按1∶2比例加入0.1% Ⅱ型膠原酶，消化、重懸后離心，再次重懸后按1×104/mL密度接種至預(yù)包被培養(yǎng)瓶中備用。將培養(yǎng)至第2代、密度為1×105/mL的細(xì)胞混懸液接種到24孔培養(yǎng)板中，待生長(zhǎng)基本融合后，根據(jù)以上操作，以PECAM-1/CD31和DAPI作為染色劑，采用HCA系統(tǒng)觀察分析。

2.1.2 海馬NVU體外培養(yǎng)體系的構(gòu)建 將原代海馬NE接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)；將AS純化、消化、重懸，于Transwell小室外側(cè)接種1×105細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)1 d；接種1×105個(gè)BMECs細(xì)胞純化、消化、重懸，并向小室內(nèi)側(cè)培養(yǎng)1 d后，將接種有AS和BMECs的小室轉(zhuǎn)移到接種有NE的6孔板內(nèi)，即得NVU體外共培養(yǎng)體系[6]。

2.2 含藥血清的制備

SD大鼠隨機(jī)分為左歸方含藥血清組、陽性藥含藥血清組、空白血清組，每日分別對(duì)應(yīng)給予臨床有效3倍量的左歸方(32.8 g/kg)、氟西汀+二甲雙胍(1.8 mg/kg，0.18 g/kg)、蒸餾水[7]，連續(xù)3 d(每日2次)灌胃給藥，末次給藥后取血靜置2 h后離心，小心吸取上清，56 ℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾膜過濾，分裝后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 模擬DD環(huán)境的構(gòu)建及分組、藥物干預(yù)

待NVU共培養(yǎng)體系構(gòu)建3 d后，給予高糖(150 mmol/L)聯(lián)合皮質(zhì)酮(200 μmol/L)進(jìn)行干預(yù)18 h[8]，構(gòu)建模擬DD狀態(tài)下NVU模型。隨機(jī)分為空白血清對(duì)照組、正常對(duì)照組、模型組、左歸方含藥血清組、陽性藥含藥血清組，依次加入10%的空白血清、陽性藥(氟西汀+二甲雙胍)含藥血清及左歸方含藥血清，同時(shí)向模型組與正常組中分別加入等量培養(yǎng)液以補(bǔ)齊液面。

2.4 海馬NVU屏障功能的測(cè)定

2.4.1 跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值(trans-epithelial electrical resistance,TEER)檢測(cè) 在共培養(yǎng)Transwell小室內(nèi)外側(cè)的AS和BMECs分別基本融合為單層時(shí)，根據(jù)儀器說明書采用Millipore ERS-2電阻儀測(cè)量TEER。

2.4.2 NVU體系滲透性檢測(cè) 待細(xì)胞共培養(yǎng)基本融合為單層時(shí)(3 d左右)，加培養(yǎng)液保證Transwell小室內(nèi)外側(cè)液面高度差為0.5 cm，將共培養(yǎng)體系置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)4 h，觀察并測(cè)量Transwell小室內(nèi)外側(cè)液面高度變化情況。

2.5 Western blot檢測(cè)海馬NVU結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)

干預(yù)18 h后去除體系所有培養(yǎng)液，PBS清洗后分別裂解并收集AS、BMECs細(xì)胞，冰上裂解60 min，離心取上清得到蛋白提取液定量備用。根據(jù)目的蛋白分子量選擇對(duì)應(yīng)濃度的分離膠，上樣、電泳，加入一抗(GFAP、CX43、Occluding)稀釋液(1∶1000) 4 ℃孵育過夜，二抗緩沖液(1: 1000)室溫孵育1 h顯影。應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，并得到相應(yīng)灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 海馬NVU各細(xì)胞形態(tài)及鑒定結(jié)果

圖1示，倒置相差顯微鏡下，對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)的BMECs、AS和NE進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。可見BMECs胞體紡錘形，呈鋪路石樣簇狀生長(zhǎng)；AS多呈卵圓形或圓形，胞體凸起較多較長(zhǎng)，胞體圓潤(rùn)光滑，折光性好；NE縱橫交錯(cuò)形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，折光性較好。采用HCA系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3種細(xì)胞分別經(jīng)特異性標(biāo)志物染色后，可見綠色熒光在胞漿中呈陽性表達(dá)，隨機(jī)選取10個(gè)視野，結(jié)果表明陽性細(xì)胞率均達(dá)95%以上。

注：A1.BMECs第二代培養(yǎng)5 d；A2.BMECs熒光鑒定；B1.AS第二代培養(yǎng)5 d；B2.GFAP熒光鑒定；C1.NE原代培養(yǎng)5 d；C2.NE熒光鑒定；神經(jīng)元(neuron,NE)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astroglia,AS)、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(The brain microvascular endothelial cells,BMECs)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)

3.2 左歸降糖解郁方對(duì)模擬DD環(huán)境下海馬NVU屏障功能的影響

圖2示，與正常對(duì)照組比較，模型組TEER值顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥含藥血清組和左歸方含藥血清組TEER值均顯著升高(P<0.05)，提示左歸方對(duì)模擬DD環(huán)境下海馬NVU體外模型屏障功能有一定的保護(hù)作用。

注：與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；正常對(duì)照組(Control Group)；空白血清對(duì)照組(Vehicle Group)；模型組(Model Group)；陽性藥(二甲雙胍+氟西汀)含藥血清組(Postive Group)；左歸方含藥血清組(Test Group)

圖3示，與正常對(duì)照組比較，模型組4 h滲漏試驗(yàn)液面差值顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥含藥血清組和左歸方含藥血清組4 h滲漏試驗(yàn)液面差值均顯著降低(P<0.05)，同樣表明左歸方對(duì)模擬DD環(huán)境下海馬NVU體外模型屏障功能具有一定保護(hù)作用。

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05；正常對(duì)照組(Control Group)；空白血清對(duì)照組(Vehicle Group)；模型組(Model Group)；陽性藥(二甲雙胍+氟西汀)含藥血清組(Postive Group)；左歸方含藥血清組(Test Group)

3.3 左歸方對(duì)模擬DD環(huán)境下海馬NVU結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的影響

圖4示，與正常對(duì)照組比較，AS細(xì)胞GFAP、CX43積分光密度值均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥含藥血清組和左歸方含藥血清組AS細(xì)胞GFAP、CX43積分光密度值均顯著升高(P<0.05)，提示在模擬DD環(huán)境下海馬NVU體外模型中，左歸方能上調(diào)GFAP、CX43蛋白的表達(dá)。

注：與正常對(duì)照組比較：*P<0.05，與模型組比較：#P<0.05；A.正常對(duì)照組(Control Group)；B.空白血清對(duì)照組(Vehicle Group)；C.模型組(Model Group)；D.陽性藥(二甲雙胍+氟西汀)含藥血清組(Postive Group)；E.左歸方含藥血清組(Test Group)；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)，間隙連接蛋白(Connexin43,Cx43)

圖5示，與正常對(duì)照組比較，模型組BMECs細(xì)胞occluding積分光密度值均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥含藥血清組和左歸方含藥血清組BMECs細(xì)胞occluding積分光密度值均顯著升高(P<0.05)，提示左歸方能逆轉(zhuǎn)模擬DD環(huán)境下海馬NVU體外模型中occluding的蛋白表達(dá)。

注：與正常對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05；A.正常對(duì)照組(Control Group)；B.空白血清對(duì)照組(Vehicle Group)；C.模型組(Model Group)；D.陽性藥(二甲雙胍+氟西汀)含藥血清組(Postive Group)；E.左歸方含藥血清組(Test Group)；occluding為緊密連接蛋白

4 討論

左歸方由經(jīng)方左歸丸化裁而來，去龜甲膠、鹿角膠、山藥3味大補(bǔ)陰之品，新增貫葉連翹以疏肝解郁，加丹參、牡丹皮以活血祛瘀，添黃芪以補(bǔ)氣健脾，再輔以杜仲以增牛膝之補(bǔ)肝腎之功。

NVU涵蓋神經(jīng)元和BBB 2個(gè)部分，并重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及腦微血管之間的相互作用[9]，故可從整體角度闡述神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制與治療機(jī)制。TEER和4 h滲漏試驗(yàn)均是檢測(cè)BBB通透性的經(jīng)典方法，其中TEER測(cè)量反映生物屏障對(duì)帶電離子對(duì)的通透性，是檢測(cè)血腦屏障通透性最敏感的指標(biāo)之一[10]。而4 h滲漏試驗(yàn)則可直接反映血腦屏障的完整性。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，經(jīng)左歸方含藥血清處理后，模擬DD環(huán)境下NVU模型中的TEER值提高，表明該方對(duì)模擬DD環(huán)境下NVU模型的屏障結(jié)構(gòu)具有一定保護(hù)作用。AS骨架蛋白GFAP的表達(dá)反映AS的功能狀態(tài)。CX-43主要存在于AS和NE，是成年哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最強(qiáng)的縫隙連接蛋白[11]。有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)可通過控制CX43等磷酸化過程而保持半通道關(guān)閉狀態(tài)[12]。occluding是BMECs與AS之間的中間橋梁蛋白，具有柵欄功能和屏障調(diào)節(jié)功能[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DD組GFAP、CX-43和occluding 3種結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)均有下降，提示BMECs與AS之間、AS與NE之間的連接均受到損傷，同時(shí)AS的數(shù)目也呈下降趨勢(shì)。而陽性藥(二甲雙胍+氟西汀)和左歸方均可恢復(fù)連接蛋白的表達(dá)，提示左歸方對(duì)模擬DD環(huán)境下NVU模型具有保護(hù)作用，且可能是通過影響GFAP、CX-43以及occluding的表達(dá)，保護(hù)NVU各環(huán)節(jié)之間的連接功能而發(fā)揮的。

綜上所述，左歸方可通過上調(diào)GFAP、CX43和occluding蛋白表達(dá)，維持海馬NVU的完整性，實(shí)現(xiàn)對(duì)DD狀態(tài)下海馬NVU的修復(fù)作用。本研究結(jié)果證明了NVU可作為研究DD的一個(gè)靶點(diǎn)，但其具體的信號(hào)通路及傳導(dǎo)過程還需做進(jìn)一步的深入研究。