風熱清口服液的抗炎鎮痛藥效作用及其機制研究?

歐凱西， 劉 捷， 趙玉民， 張 緣， 周子意， 余成浩△

(1.成都中醫藥大學基礎醫學院，成都 611137；2.西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 611137)

風熱清口服液由“桔梗湯”和“青黛飲”兩方加熊膽粉組成，縱觀全方具有清熱解毒、宣肺透表、利咽化痰的功能，適用于外感風熱所致的發熱、微惡風寒、頭痛、咳嗽、流涕、口渴、咽痛以及急性上呼吸道感染見上述癥狀者[1-2]。已有學者對風熱清口服液的部分藥效學進行了研究及探索，但其鎮痛藥效作用及抗炎鎮痛的作用機制尚未見文獻報道。本研究通過小鼠二甲苯耳腫脹試驗、小鼠醋酸扭體試驗以及小鼠熱板試驗探討風熱清口服液的抗炎鎮痛藥效作用及其機制，為風熱清口服液臨床運用提供實驗參考及依據。本研究已通過成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查，倫理學批號2020-13。

1 材料

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠150只，雌雄兼用，體質量18～22 g，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2019-0010。飼養于成都中醫藥大學動物中心，溫度維持在20～25 ℃，濕度維持在40%～70%。

1.2 主要藥品及試劑

風熱清口服液(由四川省新鹿藥業有限公司提供，規格：10 mL/瓶，國藥準字Z10950074)；醋酸地塞米松(由浙江仙琚制藥股份有限公司生產，規格：0.75 mg/片，產品批號：191059)；鹽酸曲馬多緩釋片(Farmaceutici Formenti S.p.A.公司生產，德國格蘭泰有限公司包裝，規格：0.1 g/片，批號：612R01)；二甲苯(天津市致遠化學試劑有限公司，批號：20200720；含量≥99.0%)；冰醋酸(天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2020071046；含量≥99.5%)；ELISA試劑盒腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α，依科賽生物科技有限公司，貨號：22J289)；白介素10(interleukin-10,IL-10，貨號：22J295)、白介素4(interleukin-4,IL-4，貨號：22J271)試劑盒均購自依科賽生物科技有限公司；組胺(histamine,HIS，貨號：1W16HYANYC)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PEG2，貨號：6 MQ6Z23HQC)、β-內啡肽(β-endorphin,β-EP，貨號：AQK27ESQ2Y)、緩激肽(bradykinin,BK，貨號：SHMCLQPZCH)試劑盒均購自伊萊瑞特生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒(大連美侖生物技術有限公司，貨號：MA0082-2-Jan-09F)。

1.3 主要儀器

電子天平(上海越平科學儀器制造有限公司FA2004B)；電動勻漿器(天根OSE-Y300)；酶標儀(BioTek CYT5MFV)；低溫離心機(四川蜀科儀器有限公司18091304)；RB-200熱板儀(成都泰盟軟件有限公司)。

1.4 分組及藥液配制

將昆明小鼠隨機分為5組，模型組、陽性藥對照組(醋酸地塞米松組或鹽酸曲馬多緩釋片組)、風熱清口服液低劑量組、風熱清口服液中劑量組、風熱清口服液高劑量組。醋酸地塞米松組：給藥量為3 mg/kg，實驗用蒸餾水配制成0.3 mg/mL的混懸液備用；鹽酸曲馬多緩釋片組：給藥量為30 mg/kg，實驗用蒸餾水配制成3 mg/mL的混懸液備用；風熱清口服液低劑量組：給藥量為5.0125 g/kg，實驗將風熱清口服液原液用蒸餾水稀釋4倍備用；風熱清口服液中劑量組：給藥量為10.025 g/kg，實驗將風熱清口服液原液用蒸餾水稀釋2倍備用；風熱清口服液高劑量組：給藥量為20.05 g/kg，實驗用風熱清口服液原液。

2 方法

2.1 抗炎試驗

觀察風熱清口服液對小鼠二甲苯耳廓腫脹的影響。取昆明小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組各10只。適應性喂養3 d，醋酸地塞米松組作為陽性藥對照組，按組分別灌胃蒸餾水、醋酸地塞米松藥液、風熱清口服液藥液，給藥體積為10 mL/kg，每日1次，連續7 d。末次給藥1 h后，用移液槍取50 μL二甲苯，均勻涂抹于每組小鼠右耳的正反兩面致炎，并觀察昆明小鼠致炎后的狀態，涂抹二甲苯30 min后處死昆明小鼠，沿耳廓基線分別剪下左耳和右耳，并用打孔器在左右耳同一位置取直徑為8 mm的圓形耳片，用萬分之一電子分析天平稱耳片質量，按以下公式計算小鼠耳腫脹度和腫脹抑制率：腫脹度=右耳片質量-左耳片質量。耳腫脹抑制率=(模型組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度)/模型組平均耳腫脹度×100%。

將每組取下的右耳放入EP管中，-80 ℃保存，待之后制備耳組織勻漿提取蛋白，用ELISA法檢測制備的組織勻漿上清液中TNF-α、IL-10、IL-4和組胺含量。

2.2 鎮痛試驗

2.2.1 風熱清口服液對小鼠醋酸扭體的影響 取昆明種小鼠50只，雌雄各半，按隨機數字表法分為5組各10只，鹽酸曲馬多緩釋片組作為陽性藥對照組，按組分別灌胃蒸餾水、鹽酸曲馬多緩釋片藥液、風熱清口服液藥液，給藥體積10 mL/kg，每日1次，連續7 d。末次給藥1 h后，在室溫22 ℃環境下腹腔注射0.6%醋酸10 mL/kg，觀察注射醋酸后的小鼠狀態，以小鼠后肢及軀干伸長、腹部內陷、臀部高起1次定義為1次扭體反應，并記錄扭體反應的潛伏期以及15 min內扭體次數。用以下公式計算出扭體抑制率：扭體抑制率=[(模型組扭體平均次數-給藥組扭體平均次數)/模型組扭體平均次數]×100%。小鼠扭體反應觀察結束后迅速摘眼球取血，分離血清，-80 ℃保存，ELISA法檢測小鼠血清中PGE2、β-EP、BK的含量。

2.2.2 風熱清口服液對小鼠熱板的影響 熱板溫度調節至(55±0.5) ℃，將昆明小鼠置于熱板上，分別測定給藥前每只昆明小鼠的正常痛閾值(以小鼠置于熱板上至開始舔舐后足所需要的時間作為痛閾值)，篩選基礎痛閾值在5 s～30 s的雌性昆明小鼠50只，隨機分為5組各10只。末次給藥后30 min、60 min、90 min、120 min分別測量各小鼠的痛閾值，記錄結果并進行比較。

小鼠觀察結束后迅速摘眼球取血，分離血清，-80 ℃保存，ELISA法檢測小鼠血清中PGE2、β-EP、BK的含量。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 各組小鼠耳腫脹結果

表1示，模型組昆明小鼠涂抹二甲苯后均出現煩躁不安、抓撓右耳，可見右耳快速紅腫充血，其充血紅腫情況與左耳比較有明顯差異。風熱清口服液低、中劑量組比模型組小鼠耳腫脹程度明顯減輕(P<0.05)。

表1 風熱清口服液對二甲苯致炎小鼠耳腫脹的影響

3.2 各組小鼠耳組織中炎癥因子含量結果

表2示，風熱清口服液低劑量組與模型組比較，可減少小鼠耳組織中TNF-α、組胺含量(P<0.05)，并提高IL-4含量(P<0.01)；風熱清口服液中劑量組與模型組比較，可減少小鼠耳組織中組胺含量(P<0.05)，提高IL-4含量(P<0.05)，風熱清口服液各組與模型組比較，耳組織中IL-10的含量差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 風熱清口服液對二甲苯致炎小鼠耳組織中TNF-α、IL-10、IL-4、組胺的影響

3.3 各組小鼠醋酸扭體試驗結果

表3示，腹腔注射0.6%醋酸后模型組小鼠扭體陽性率為100%，出現典型的扭體動作軀干和后肢因刺激而伸長、腹腔凹陷、臀部高起。風熱清口服液低、中、高劑量組扭體潛伏期與模型組比較扭體潛伏期有一定的延長，但差異無統計學意義(P>0.05)。風熱清口服液低劑量組與模型組比較可減少小鼠扭體次數(P<0.05)，且低劑量組扭體抑制率達到49.02%。

表3 風熱清口服液對小鼠醋酸扭體的影響

3.4 各組小鼠血清PGE2、β-EP、BK含量結果

表4示，風熱清口服液低劑量能降低醋酸扭體小鼠血清中的PGE2含量(P<0.05)；風熱清口服液低、中、高劑量能提高醋酸扭體小鼠血清中的β-EP含量(P<0.05)；風熱清口服液低、中、高劑量組中檢測到BK含量與模型組比較雖有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 風熱清口服液對扭體小鼠血清PGE2、β-EP、BK含量的影響

3.5 各組小鼠熱板試驗結果

表5示，將昆明小鼠置于溫度調節至(55±0.5) ℃的熱板上，小鼠因疼痛而出現舔后足的表現。各組之間給藥前的基礎痛閾值差異無統計學意義(P>0.05)。風熱清口服液中、高劑量能延長小鼠給藥30 min后的痛閾值(P<0.05)；風熱清高劑量能延長小鼠給藥60 min后的痛閾值(P<0.01)。

表5 風熱清口服液對熱板小鼠的影響

3.6 各組小鼠血清PGE2、β-EP、BK含量結果

表6示，風熱清口服液高劑量能降低熱板小鼠血清中PGE2含量(P<0.05)；風熱清口服液中、高劑量能降低熱板小鼠血清中BK含量(P<0.01)，并提高熱板小鼠血清中β-EP含量(P<0.01)。

表6 風熱清口服液對熱板小鼠血清PGE2、β-EP、BK含量的影響

4 討論

風熱清口服液主要由山銀花、青黛、熊膽粉、瓜蔞皮、桔梗、甘草組成。山銀花、桔梗可疏散風熱，清利咽喉，熊膽粉、青黛清熱解毒，瓜蔞皮生津養陰，全方配伍精當，可運用于外感風熱證。小鼠二甲苯耳腫脹模型是經典的抗炎模型，二甲苯可在涂抹局部誘導組胺、激肽等炎癥介質釋放，進而導致局部毛細血管通透性增加和炎癥細胞浸潤[3]。其中最關鍵的促炎因子則是TNF-α，該因子能夠促進上皮、淋巴細胞產生多種黏附分子，并誘導趨化因子的生成，從而介導炎性細胞向炎癥局部聚集，最終造成組織損傷、炎癥等病理變化[4]。而當機體遭受炎癥刺激時，不僅會分泌促炎因子，也會產生大量抗炎因子，其中IL-4、IL-10是單核巨噬細胞分泌促炎因子的重要負調節因子[5，6]，可以抑制促炎細胞因子的表達，限制組織損傷[7]。本研究表明，風熱清口服液低、中劑量對二甲苯耳腫脹模型有抑制作用，提示風熱清口服液具有抗炎作用。對其作用機制進一步研究發現，風熱清口服液低劑量組能抑制耳組織中致炎因子TNF-α的含量，且低劑量和中劑量組能抑制耳組織中組胺的含量，同時提高抗炎因子IL-4的含量，說明風熱清口服液不僅能降低促炎因子，還能促進抗炎因子的分泌，通過正負反饋雙向調節達到抑制炎癥作用。

小鼠熱板試驗與醋酸扭體試驗是熱刺激和化學刺激的致痛模型。在鎮痛研究中，PGE2是重要指標，許多實驗都表明在外周和中樞組織中PGE2具有誘導疼痛的作用。Ferreira等[8]通過對大鼠皮下注射PGE2，可導致大鼠痛覺過敏。β-EP是一種內源性阿片肽，具有調節應激反應、免疫機能和中樞鎮痛等功能，它可通過減少神經元P物質釋放，抑制傷害性感受器興奮，達到抑制痛覺傳導的作用[9]。BK在調節疼痛感覺的有關離子通道表達方面起關鍵作用，是公認的致痛物質[10]。本研究表明，風熱清口服液低劑量能抑制醋酸扭體小鼠的扭體次數，且風熱清口服液低中高劑量均能提高醋酸扭體小鼠血清中鎮痛物質β-EP的含量，風熱清口服液低劑量組還能抑制致痛物質PGE2的含量。在小鼠熱板試驗中，風熱清中劑量在給藥30 min后對小鼠熱板疼痛反應具有抑制作用，風熱清高劑量在給藥30、60 min對小鼠熱板疼痛反應具有抑制作用。風熱清口服液高劑量能抑制熱板小鼠血清中PGE2、BK含量，并提高β-EP含量；風熱清口服液中劑量能減少BK含量，提高β-EP含量，說明風熱清口服液對熱刺激及化學刺激的致痛模型均具有一定的鎮痛作用。并在機制研究中發現，風熱清口服液能通過減少致痛物質、提高鎮痛物質，共同達到鎮痛作用。

綜上所述，風熱清口服液具有抗炎鎮痛作用，其抗炎作用機制可能與抑制耳組織中促炎因子TNF-α、組胺和增強抗炎因子IL-4的含量有關，鎮痛作用機制可能與抑制血清中的致痛物質PGE2、BK含量和促進鎮痛物質β-EP的釋放有關。