白藜蘆醇調節TLR4/NF-κB信號通路影響人前列腺癌PC3細胞株凋亡的研究*

冉亨勇，蒲 軍，李明輝，何 毅

(1.邛崍市醫療中心醫院腫瘤科，四川邛崍 610000；2.西南醫科大學附屬醫院泌尿外科，四川瀘州 646000)

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)化學名為3，4′，5-三羥基-1，2-二苯乙烯，是一種天然抗氧化物和環氧合酶(cyclooxygenase，COX)抑制劑。Res在預防慢性炎性疾病、抗冠心病、癌癥預防等方面發揮重要作用[1]，其機制與清除自由基，抑制COX-2表達，誘導一氧化氮合成酶合成，抑制脂氧合酶與蛋白激酶C表達，抑制脂質過氧化等有關[2]。男性前列腺癌發病率較高，美國前列腺癌發病率位居男性腫瘤第2位，我國前列腺癌發病率也較高[3]。炎癥與前列腺癌的發生密切相關，急性或慢性炎癥不僅會導致癌變，還參與前列腺癌進展[4]。Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)是人體參與炎癥的主要受體，其中TLR4能誘導腫瘤細胞釋放多種細胞因子或上調抗凋亡信號等一系列效應[5]。TLR4信號通路參與前列腺癌、乳腺癌、結腸癌等多種腫瘤的發生、發展過程，主要與促進腫瘤細胞的抗原性、增強機體對其免疫清除能力、促進腫瘤細胞增殖、免疫逃逸、凋亡抵抗和侵襲能力等有關。已有研究報道，TLR4在人前列腺癌PC3細胞中通過核因子-κB(NF-κB)信號通路促進血管內皮生長因子(VEGF)和白細胞介素(IL)-8的分泌，影響人前列腺癌PC3細胞的生存[6]。盡管Res對前列腺癌有防治作用，但較少有研究探討其影響前列腺癌細胞凋亡的作用與調節TLR4/NF-κB信號通路的關系，故本研究探討Res是否通過抑制TLR4/NF-κB信號通路有關蛋白和炎性因子表達影響前列腺癌細胞凋亡，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640培養基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)，Res(成都普思生物科技股份有限公司)；TAK242(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒、Hochest33342熒光染色試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；兔抗人β-actin、TLR4、NF-κB、Bcl-2、Bax單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體(英國Abcam公司)；IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與分組

人前列腺癌PC3細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所，選用RPMI1640培養基，加入10%胎牛血清后在37 ℃、5%CO2條件下常規培養。Res純度為99%，超聲助溶于超純水中。實驗取對數生長期細胞，將細胞分為陰性對照組，Res高、中、低劑量組，TLR4阻斷劑組。陰性對照組細胞常規培養，不做其他處理；Res各劑量組分別給予40、20、10 μmol/L Res處理48 h；TLR4阻斷劑組給予1 μg/mL TAK242處理48 h。

1.2.2CCK-8法檢測Res對人前列腺癌PC3細胞株細胞增殖的影響

細胞常規胰酶消化后制成懸液，調整細胞數為1×106/L，將細胞接種于96孔板中，每孔90 μL，在37 ℃、5%CO2條件下常規培養48 h，細胞處理后每孔加入CCK8試劑10 μL繼續培養1 h，酶標儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值(A值)，計算細胞生長存活率，細胞存活率=A給藥組/A陰性對照組×100%。

1.2.3Hochest33342熒光染色檢測人前列腺癌PC3細胞株細胞凋亡

收集細胞懸浮液于1 mL培養基中，加入10 μL Hochest33342儲存液(100 mg/L，蒸餾水溶解)，染色15 min；將細胞置于冰上冷卻后，離心，去上清液，將細胞重懸于1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加人5 μL碘化丙啶(PI)儲存液(1 g/L，蒸餾水溶解)，混勻，避光放置10 min后熒光顯微鏡觀察。

1.2.4Western blot檢測人前列腺癌PC3細胞株TLR4、NF-κB、Bcl-2及Bax蛋白表達

細胞處理后棄上清液，每孔加入50 μL裂解液裂解細胞，提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度，計算樣品加樣量。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠，每孔上樣20 μL，100 V電泳90 min，200 mA轉膜90 min，5%牛血清清蛋白(BSA)封閉1.h，一抗按1∶1 000稀釋后同膜一起轉入抗體封閉盒內，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜4次，每次10 min。加入二抗1∶2 000，孵育1 h，洗膜4次，每次10 min，電化學發光(ECL)顯色液顯影，以β-actin為內參，蛋白條帶灰度值用Image proplus6.0軟件測定，根據TLR4/β-actin和NF-κB/β-actin條帶灰度值比值進行統計學分析。

1.2.5ELISA法檢測人前列腺癌PC3細胞株IL-6和TNF-α表達

每孔調整細胞數為1×105/L，接種于96孔板，處理細胞后取細胞上清液按1 000×g離心10 min，每孔加入樣品稀釋液40 μL，待測樣品10 μL，酶標板輕輕晃動，37 ℃孵育30 min，撕掉封板膜，棄去液體，甩干，加滿洗滌液，靜置30 s后甩干，反復3次，每孔加入酶標液50 μL，37 ℃孵育30 min，洗滌3次，加顯色液A 50 μL，顯色液B 50 μL，搖勻，37 ℃避光顯色，加終止液50 μL，空白調零，酶標儀450 nm波長下檢測。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 Res對人前列腺癌PC3細胞株增殖的影響

Res各劑量組人前列腺癌PC3細胞株的細胞存活率為70.10%～78.35%；與陰性對照組相比，10 μmol/L及以上Res劑量組能抑制人前列腺癌PC3細胞株增殖，呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 Res對人前列腺PC3細胞株增殖影響

2.2 Res對人前列腺癌PC3細胞株細胞凋亡的影響

實驗結果顯示陰性對照組細胞呈淺藍色，凋亡細胞較少；Res各劑量組可見凋亡細胞呈亮藍色，并可見細胞核固縮、核碎裂等現象。Res各劑量組抑制Bcl-2表達，促進Bax表達，各劑量組Bcl-2/Bax比值降低，除Res 10 μmol/L組外，與陰性對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1、2，表2。

A：陰性對照組；B：TLR4阻斷劑組；C：Res 40 μmol/L組；D：Res 20 μmol/L組，E：Res 10 μmol/L組。圖1 Res對人前列腺癌PC3細胞株細胞凋亡的影響(Hochest33342熒光染色，×400)

圖2 Res對人前列腺癌PC3細胞株細胞Bcl-2/Bax表達的影響

2.3 Res對人前列腺癌PC3細胞株細胞TLR4及NF-κB表達的影響

Res各劑量組、TLR4阻斷劑組TLR4相對表達水平明顯降低(P<0.05)；Res 20、40 μmol/L劑量組、TLR4阻斷劑組NF-κB相對表達水平明顯降低(P<0.05)；Res各劑量組與TLR4阻斷劑組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3、表2。

圖3 Res對人前列腺癌PC3細胞株細胞TLR4及NF-κB表達的影響

表2 Res對人前列腺癌PC3細胞株TLR4、NF-κB表達及Bcl-2/Bax的影響

2.4 Res對人前列腺癌PC3細胞株炎性因子表達的影響

與陰性對照組比較，Res各劑量組IL-6、TNF-α水平均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 Res對人前列腺癌PC3細胞株IL-6和TNF-α表達的影響

續表3 Res對人前列腺癌PC3細胞株IL-6和TNF-α表達的影響

3 討 論

前列腺癌是目前男性發病率較高的腫瘤之一，尤其在北美和歐洲地區[7]。目前其治療仍以手術、化療等方式為主。盡管近年來不斷有新的化療藥物被批準用于治療前列腺癌，如多西他賽、卡巴西他賽，但前列腺癌仍是男性因癌癥死亡的第五大原因，占男性癌癥病死率的6.6%[8]；而在亞洲國家，前列腺癌1年、5年和10年存活率分別為81.0%、61.9%和36.2%[9]。

大量臨床試驗表明，中藥在預防前列腺癌方面具有積極作用，許多從中草藥提取的化合物已被證明可通過不同途徑抑制前列腺癌的發生、發展，有望在未來用于前列腺癌的臨床治療[10]。Res的抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用一直是腫瘤防治的研究熱點，目前已有研究證實Res對癌癥的防治具有有益作用，而且不良反應少。一項為期10年的流行病學研究表明，通過食用葡萄而非葡萄酒攝入Res的女性患乳腺癌的風險降低了50%以上[11]。Res的一些Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗也正在進行中。本研究結果顯示，10 μmol/L及以上濃度的Res即可抑制人前列腺癌PC3細胞株的生長，促進細胞凋亡，提示Res具有抑制人前列腺癌PC3細胞株生長，促進其凋亡的作用。

凋亡蛋白Bcl-2/Bax是反映凋亡發生、發展的經典蛋白，因此進一步分析Res對凋亡蛋白Bcl-2/Bax是否產生影響。Bcl-2具有抑制細胞凋亡，延長細胞生存期的作用。Bax則是促進細胞凋亡蛋白，具有對抗Bcl-2蛋白抑制細胞凋亡的作用。Bcl-2與Bax形成二聚體的比例決定了細胞凋亡與存活的狀態，即當Bcl-2/Bax比值增加，細胞存活率高，Bcl-2/Bax比值降低，細胞存活率則降低[12]。本研究結果顯示，Res能抑制Bcl-2表達，促進Bax表達，降低了Bcl-2/Bax比例，提示Res促進人前列腺癌細胞凋亡的作用與此有關。

臨床前研究表明，慢性炎癥與前列腺癌進展有關，如在前列腺腫瘤標本和切除的組織中發現慢性炎癥，其他分子、實驗和臨床的證據也表明慢性炎癥和前列腺癌風險呈正相關[13]，提示炎癥可能是前列腺癌發生的驅動因素。炎性介質被認為是參與前列腺癌發生、發展的因素，有可能成為治療干預的靶點；而炎癥相關的白細胞局部浸潤、信號分子(包括細胞因子和趨化因子)產生，則與下游效應器如NF-κB、Wnt通路激活有關[14]。TLR4信號通路也是參與炎癥發生、發展的重要通路，已有研究顯示前列腺癌細胞中TLR2、4、9的激活可能促進腫瘤生長[15]。故本研究進一步分析Res是否通過影響TLR4通路蛋白表達，影響下游炎性因子，從而達到抑制前列腺癌細胞增殖的作用。因此，檢測了TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-α的表達。結果顯示，Res干預后前列腺癌細胞中TLR4蛋白表達水平明顯降低，與使用TLR4抑制劑相似，同時下游NF-κB蛋白表達水平和炎性因子(IL-6、TNF-α)表達水平也明顯降低，提示Res抑制腫瘤細胞生長可能與阻斷TLR4，以及抑制下游NF-κB蛋白表達和炎性因子IL-6和TNF-α表達有關。

綜上所述，Res能抑制人前列腺癌PC3細胞增殖，促進其凋亡，可能與抑制TLR4、NF -κB蛋白，下調Bcl-2/Bax比值，減少炎性因子IL-6和TNF-α表達有關，其是否涉及其他信號通路尚有待進一步研究。