豬肉新鮮度快速檢測方法及相關(guān)性分析

袁寶多，馬坤瑛，端肖楠，尹玉偉

1. 河南進口肉類指定口岸漯河查驗區(qū)服務(wù)中心（漯河 462000）；2. 漯河海關(guān)（漯河 462000）；3. 紅實農(nóng)場（項城 466236）

隨著生活水平的提高，人們對肉類品質(zhì)及安全性要求越來越高，在日常膳食結(jié)構(gòu)中，肉制品占很大比例，肉類的品質(zhì)與人們身體健康密切相關(guān)[1]。豬肉作為我國消費者主要的肉食品之一，因極易腐敗變質(zhì)，對人們的健康具有一定的危害[2]。

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）作為評價肉品新鮮程度的重要指標(biāo)[3]，由于TVB-N測定操作方法較復(fù)雜、耗時長、滴定終點判定存在誤差，無法達到市場上肉品快速、大批量檢測的要求[4]。豬肉在腐敗過程中由于微生物和酶的作用產(chǎn)生大量的導(dǎo)電物質(zhì)，從而大大提高了導(dǎo)電性。目前，電導(dǎo)率法已被廣泛應(yīng)用于肉品的檢測[5]。同時，pH可以反映豬肉肌糖元酵解速度，其值的變化與肉的腐敗變質(zhì)有關(guān)[6]，影響其肉制品的品質(zhì)，因此，pH也是評價豬肉品質(zhì)的重要指標(biāo)[7]。過氧化物酶的活性水平是檢測肉質(zhì)的重要指標(biāo)之一，新鮮肉類中過氧化物酶活性較低，而變質(zhì)肉中的過氧化物酶活性相對較高[8]。

為了探索快速、簡便的方法來確定肉的新鮮度，通過研究豬肉腐敗變質(zhì)過程中電導(dǎo)率、pH與豬肉TVB-N的變化規(guī)律以及探討電導(dǎo)率、pH與豬肉TVB-N之間的的相關(guān)性，為應(yīng)用電導(dǎo)率、pH快速評價豬肉的新鮮度提供理論依據(jù)。此外，以過氧化物酶含為指標(biāo)，研究3, 5, 3′, 5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和過氧化物酶的顯色反應(yīng)，為豬肉新鮮度快速檢測提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉：采購于農(nóng)貿(mào)市場剛屠宰的新鮮健康豬肉。

硼酸、鹽酸及無水乙醇，北京化工廠；甲基紅-乙醇指示劑，天津市大茂化學(xué)試劑廠；次甲基藍指示劑，北京譜析科技有限公司；碳酸鈉、碳酸鉀，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸，河南拓源化工產(chǎn)品有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

主要使用的儀器設(shè)備，見表1。

表1 試驗儀器設(shè)備一覽表

1.3 試驗方法

1.3.1 豬肉樣品

將從市場購買的新鮮豬肉，存放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（溫度為25 ℃，濕度為80%），加速豬肉樣品的腐敗，每隔6 h取出所需樣品量，進行各項指標(biāo)的測定。

1.3.2 pH測定方法

準(zhǔn)確稱取（10.00±0.01）g切碎的豬肉樣品，消除脂肪和結(jié)締組織，然后用勻漿機勻漿，加入100 mL蒸餾水，繼續(xù)勻漿，然后取濾液，用pH計測定豬肉濾液的pH。

1.3.3 電導(dǎo)率測定方法

準(zhǔn)確稱取（10.00±0.01）g切碎的豬肉樣品，用勻漿機進行勻漿，然后加入100 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢杈鶆颉㈦妼?dǎo)電極插入備好的試樣中，讀取精度為0.01 ms/cm[9]。

1.3.4 TVB-N測定方法

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》對豬肉采用凱式定氮法測定樣品中TVB-N含量[10]。

1.3.5 試紙顯色法測定過氧化物酶的方法

準(zhǔn)確稱取（10.00±0.01）g切碎的豬肉樣品，將肉去除脂肪和結(jié)締組織，用勻漿機勻漿，加入100 mL的蒸餾水，繼續(xù)勻漿，然后過濾，濾液即為過氧化物酶原液。具體操作步驟參考王強等[11]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件進行方差分析和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮豬肉電導(dǎo)率、pH和TVB-N變化規(guī)律結(jié)果與分析

2.1.1 新鮮豬肉電導(dǎo)率變化規(guī)律結(jié)果與分析

肉腐敗過程中微生物和酶的作用，導(dǎo)致肉中成分發(fā)生變化，尤其細胞中礦物質(zhì)鹽類等物質(zhì)會溶出，其中絕大多數(shù)物質(zhì)為導(dǎo)電性離子，如鈉、鉀、鈣離子等[12]。為了探究肉中導(dǎo)電性物質(zhì)的變化規(guī)律，對豬肉的電導(dǎo)率進行測定。如圖1所示，新鮮肉在溫度25 ℃、濕度80%的條件下，恒溫恒濕加速腐敗，隨著時間的延長，電導(dǎo)率整體呈現(xiàn)上升趨勢，其中貯藏6 h時，電導(dǎo)率迅速上升，變化差異極顯著（p＜0.01）；在6～18 h時間段內(nèi)，電導(dǎo)率變化不顯著（p＞0.01），趨于平穩(wěn)；從24 h開始，電導(dǎo)率變化差異極顯著（p＜ 0.01），表明在這個時間段電導(dǎo)率極顯著地增加。

2.1.2 新鮮豬肉pH變化規(guī)律結(jié)果與分析

隨著時間的增加，豬肉的pH逐漸上升，且與肉的腐敗程度呈正相關(guān)。一般而言，pH在5.8～6.2時，為一級鮮肉；pH在6.3～6.6時，為二級鮮肉；pH＞6.6時，為腐敗肉。如圖2所示，新鮮豬肉在貯藏12 h時，pH呈波動變化，豬肉在貯藏12 h之后，pH測定值變化比較顯著（p＜0.05），pH在42 h時達到6.7±0.10。總體來看，在48 h內(nèi)，豬肉pH逐漸增加，豬肉pH在貯藏前期出現(xiàn)波動，這可能是由于肌肉中的肌糖原分解產(chǎn)生了酸性物質(zhì)（例如乳酸和磷酸），從而中和了豬肉表面細菌生長代謝產(chǎn)生的堿性物質(zhì)。由于pH增加更有利于微生物的生長，因此貯藏后期豬肉腐敗變質(zhì)更加明顯[13-14]。

圖2 豬肉的pH隨時間的變化關(guān)系

2.1.3 新鮮豬肉TVB-N值變化規(guī)律結(jié)果與分析

TVB-N值是評價豬肉新鮮度的最重要指標(biāo)之一[15]。隨著貯藏時間的延長，TVB-N不斷增加，蛋白質(zhì)腐敗分解在脫氨基、脫羧后會形成大量的揮發(fā)性堿性含氮物質(zhì)，這將逐漸降低豬肉的新鮮度[16]。通常，新鮮肉TVB-N≤15 mg/100 g，次級鮮肉TVB-N含量≤25 mg/100 g，腐敗肉TVB-N＞25 mg/100 g[17]。如圖3所示，豬肉TVB-N在貯藏0～24 h時低于15 mg/100 g，表明樣品為一級新鮮；貯藏30～42 h時，TVB-N為15～25 mg/100 g，豬肉為中等新鮮；豬肉在貯藏42 h后，豬肉樣品腐敗變化明顯，已有腐臭氣味；當(dāng)貯藏48 h時，豬肉的TVB-N達到（38.29±0.97）mg/100 g。

圖3 豬肉的TVB-N值隨時間的變化關(guān)系

2.1.4 相關(guān)性分析

豬肉在貯藏期間，各個指標(biāo)之間的相關(guān)性分析見表2。從表2可以看出，TVB-N與電導(dǎo)率和pH呈正相關(guān)，且各個指標(biāo)之間呈現(xiàn)極顯著的相關(guān)性，可作為衡量豬肉新鮮程度的指標(biāo)。

表2 各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

2.1.5 電導(dǎo)率、pH與TVB-N值的回歸分析

如圖4所示，將每個時間點所測定的電導(dǎo)率和TVB-N值進行回歸分析，以TVB-N（y，mg/100 g）為因變量，電導(dǎo)率（x，ms/cm）為自變量，得到擬合方程。電導(dǎo)率測定值和TVB-N值間相關(guān)關(guān)系檢驗為極顯著（p＜0.01），得到的擬合回歸方程為y=38.549x- 36.098，決定系數(shù)R2=0.8121，電導(dǎo)率測定值和TVB-N值間呈直線回歸關(guān)系，即時間的延長會導(dǎo)致豬肉的腐敗變質(zhì)，進而使豬肉的電導(dǎo)率增加，TVB-N也逐漸增加。通過測定豬肉的電導(dǎo)率，利用此回歸數(shù)學(xué)模型，可計算出TVB-N，從而實現(xiàn)對豬肉新鮮度的快速判定[18]。

圖4 電導(dǎo)率與TVB-N的相關(guān)性分析

如圖5所示，將每個時間點所測定的pH和TVB-N值進行回歸分析，以TVB-N（y，mg/100 g）為因變量，pH（x，A）為自變量，得到擬合方程。pH測定值和TVB-N值間相關(guān)關(guān)系檢驗為極顯著（p＜0.01），得到的擬合回歸方程為y=21.031x-117.96，決定系數(shù)R2=0.7964，pH測定值和TVB-N值間呈直線回歸關(guān)系，即時間的延長會導(dǎo)致豬肉的腐敗變質(zhì)，進而使豬肉的pH增加，TVB-N也逐漸增加。通過測定豬肉的pH，利用此回歸數(shù)學(xué)模型，可計算出TVB-N，將測得的pH依據(jù)GB 2707—2005鮮（凍）畜肉TVB-N指標(biāo)，判斷樣品的新鮮度[19]。

圖5 pH與TVB-N的相關(guān)性分析

2.2 聯(lián)苯胺顯色法對豬肉新鮮度的結(jié)果與分析

2.2.1 聯(lián)苯胺過氧化物酶顯色時間確定

如圖6所示，利用分光光度計在650 nm對其每20 s讀取一次數(shù)值，測定時間為3 min，顯色在0～60 s呈現(xiàn)較好的線性增加，60 s后增長趨于平緩，因此確定60 s為聯(lián)苯胺顯色的最佳判讀時間，且60 s時的吸光度可以較好地反映過氧化物酶活性。

圖6 肉樣中過氧化物酶-聯(lián)苯胺顯色時間變化規(guī)律

2.2.2 貯藏過程變化過氧化物酶活性的變化規(guī)律

如圖7所示，在貯藏過程中用聯(lián)苯胺顯色法每隔一定時間對肉的過氧化物酶活性進行測定，在貯藏過程中過氧化物酶活性從0～12 h降到最低，從18 h開始持續(xù)快速增長。說明豬肉中的過氧化物酶活性隨肉的腐敗先逐漸降低，由于腐敗嚴(yán)重，增殖了大量腐敗菌，微生物中也含有大量過氧化物酶，因此隨著微生物數(shù)量不斷增加，豬肉中過氧化物酶活性逐漸升高，且遠高于一開始新鮮豬肉的過氧化物酶活性[20]。因此，可根據(jù)豬肉中過氧化物酶活性變化規(guī)律，判斷豬肉的新鮮度。

圖7 豬肉貯藏過程中過氧化物酶活性變化規(guī)律

如圖8所示，將每個時間點所測定的過氧化物酶吸光度和TVB-N值進行回歸分析，以TVB-N（y，mg/100 g）為因變量，吸光度（x，B）為自變量，得到擬合方程：y=81.689x+8.2792，決定系數(shù)R2=0.933，吸光度和TVB-N值間呈直線回歸關(guān)系，即時間的延長會導(dǎo)致豬肉的腐敗變質(zhì)，進而使豬肉的過氧化物酶活性增加，TVB-N也逐漸增加。通過測定豬肉的過氧化物酶活性，利用此回歸數(shù)學(xué)模型，可計算出TVB-N，從而實現(xiàn)對豬肉新鮮度的快速檢測。

圖8 吸光度與TVB-N值的相關(guān)性分析

2.2.3 聯(lián)苯胺過氧化物酶顯色反應(yīng)物濃度配比確定

通過對TMB乙醇溶液和H2O2水溶液利用試紙法進行梯度搭配，對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TMB（0.01%，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.1%，0.12%和0.14%）和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)H2O2（0.015%，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.1%，0.2%，0.4%，0.6%和1.0%）進行單因素試驗及正交試驗，分別在揮發(fā)性鹽基氮為8和17 mg/100 g時進行試紙法試驗，加樣順序：TMB溶液、H2O2溶液、肉浸出液3種反應(yīng)物的添加量各1滴，加入肉浸出液后立即計時，記錄變色時間和現(xiàn)象。選出一級新鮮度時60 s內(nèi)不顯色，二級新鮮度時60 s內(nèi)就開始顯色的適宜濃度搭配。最終根據(jù)試驗結(jié)果，確定最佳TMB與H2O2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為0.04%∶0.04%。

2.2.4 驗證試驗

進一步對TMB與H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比0.04%∶0.04%進行試紙法驗證試驗，結(jié)果如表3所示，結(jié)果證實TMB與H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比0.04%∶0.04%時具有較好的重復(fù)性，可應(yīng)用于豬肉新鮮度的檢測。

表3 最佳濃度驗證性試驗結(jié)果

3 結(jié)論

將新鮮豬肉在25 ℃、相對濕度80%的條件下貯藏，研究其貯藏期間電導(dǎo)率、pH和揮發(fā)性鹽基氮的變化，以及試紙顯色法測定過氧化物酶活性，快速檢測豬肉的新鮮度，對豬肉過氧化物酶活性水平進行研究，通過過氧化物酶顯色識別豬肉新鮮程度的方法。結(jié)果表明：隨著貯藏時間的延長，TVB-N不斷增加，豬肉的電導(dǎo)率、pH也隨豬肉貯藏時間的延長而增加。通過相關(guān)性分析，電導(dǎo)率、pH和揮發(fā)性鹽基氮呈顯著相關(guān)，可以作為衡量豬肉新鮮程度的指標(biāo)。其中電導(dǎo)率測定值和TVB-N值間相關(guān)關(guān)系檢驗為極顯著（p＜ 0.01），得到的擬合回歸方程為y=38.549x-36.098，決定系數(shù)R2=0.8121，電導(dǎo)率測定值和TVB-N值之間呈直線回歸關(guān)系；pH測定值和TVB-N值間得到的擬合回歸方程為y=21.031x-117.96，決定系數(shù)R2=0.7964，pH測定值和TVB-N值之間呈直線回歸關(guān)系，測定豬肉的電導(dǎo)率和pH，通過TVB-N與二者間的回歸關(guān)系方程，即可求出TVB-N，實現(xiàn)豬肉新鮮度的簡便、快速判定。此外，過氧化物酶吸光度與TVB-N呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，制備的顯色紙對豬肉新鮮度有指示作用，其中TMB與H2O2的最佳配比為0.04%∶0.04%，進而能夠方便地用于判斷市場上待售豬肉新鮮程度。目前，顯色法作為一種新型的檢測方法，對肉制品市場的無損檢測方法提供了一定的參考，新鮮度顯色法在豬肉保鮮和檢測方面具有較大的潛力。