可視化LAMP檢測阿膠及其保健食品中馬源性成分

高玉梅，柳毅，李洪，尹斯雅

1. 河北工程大學醫學院（邯鄲 056002）；2. 保定市產品質量監督檢驗所（保定 071051）；3. 河北化工醫藥職業技術學院（石家莊 050026）

馬科動物驢（Equus asinusL.）的干燥皮或鮮皮經煎煮、濃縮制成的固體膠為阿膠（Asini coriiColla）[1]，具有滋陰潤燥、補血止血的功效，是傳統的補藥。因其食藥同源，常作為功效原料被廣泛添加到保健食品中。阿膠類保健食品因其形式多、構成成分復雜，在保健食品市場占據舉足輕重的地位[2-4]。近些年由于驢養殖業發展滯后，驢皮供應量呈逐年下滑之勢，原料價格大幅上升，不法商販受利益的驅使，在阿膠藥材及其保健制品中摻入馬皮、豬皮、牛皮、騾皮及羊板皮等偽皮膠充數添加到阿膠及其保健食品中[5]。由于馬和驢是同屬同科，騾又為驢與馬的雜交品種。騾皮、馬皮與驢皮在色澤、性狀等方面十分近似難以區分，因此市場上以騾皮、馬皮等作為偽皮制造阿膠較為常見，這嚴重打擊了消費者的信心和合法商家的權益[6-7]。

阿膠及其保健食品中動物源成分的檢測方法目前多將馬源性成分作為檢測目標，利用液相色譜串聯質譜法和實時熒光PCR法進行分析[8-11]。但這兩種方法檢測成本高，樣品的前處理時間較長，都需要昂貴儀器，且需要專業的技術人員，不利于基層推廣。環介導等溫擴增（LAMP）技術反應結果可直接通過肉眼進行觀察，省去了繁瑣的電泳過程[12]。所用設備簡單、成本低，可滿足快速檢測的需要，具有廣泛的應用前景[13]。試驗以馬的線粒體ATPase6基因作為靶基因并設計引物[14]。利用LAMP擴增技術原理建立可視化環介導等溫擴增技術檢測阿膠及其保健食品中馬源性成分的方法，并評估此方法的特異性、靈敏度和符合率，為保障阿膠及其保健食品的品質和市場監管提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

試驗選用自制阿膠樣品及其保健食品：市場購買6種驢皮、馬皮、馬騾皮、牛皮、羊皮、豬皮，委托阿膠生產企業按生產工藝制作膠類產品及其保健食品，共5種劑型（阿膠片、阿膠粉、阿膠糕、阿膠口服液、阿膠含片）。

阿膠標準物質（中國食品藥品檢定研究院，批號121274-201703）；馬肉、驢肉、馬騾肉、羊肉、牛肉、豬肉、狗肉、狐貍肉、鹿肉、雞肉、兔肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、魚肉、蝦肉、鼠肉、駱駝肉（石家莊海關技術中心）。

1.1.2 儀器與設備

PCR擴增儀（德國Biometra公司）；UVIPro凝膠成像儀（英國UVItec華粵企業有限公司）；Nanodrop 2000分光光度計（美國Thermo scientific公司）；CFX96 Touch實時熒光PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.1.3 主要試劑

脫氧核糖核苷酸（dNTPs）、100 bp DNA Ladder Marker、10×Buffer、MgSO4、Bst DNA聚合酶（Large fragment）、Alu I限制性內切酶、SYBR Green I熒光染料（大連寶生物有限公司）；LAMP引物、實時熒光定量PCR探針及引物（北京華大基因合成）；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒（北京華大生物有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物基因組DNA的提取

按試劑盒提取法提取供試動物基因組DNA，作為體系模板。

1.2.2 引物設計

試驗選取馬的線粒體ATPase6基因作為靶基因。根據Genebank中公布的馬的線粒體ATPase6基因序列進行BLAST同源性分析，使用DNAMAN和Primer premier 5.0軟件設計特異性引物，具體的引物信息見表1。

表1 馬的線粒體ATPase 6基因

1.2.3 LAMP 反應體系

經過優化，建立最佳的LAMP擴增體系：內引物FIP和BIP（5 μmol/L）各2 μL，外引物F3和B3（5 μmol/L）各1 μL，4 μL dNTPs（2 mmol/L each），2.5 μL 10×Bst DNA reaction buffer，2 μL MgSO4（25 mmol/L），1 μL Bst DNA 聚合酶（8000 U/mL），1.0 μL模板DNA，用去離子水補足體系至20 μL。添加所需試劑后，離心管放入水浴鍋中，于62 ℃反應70 min，并于80 ℃保持5 min，終止反應。

1.2.4 LAMP引物特異性分析

選取18種樣品進行引物特異性分析，樣品經過處理，分別提取模板后，按照優化好的LAMP反應體系進行反應。向LAMP擴增產物中加入1 μL熒光染料SYBR Green I，肉眼觀察顏色變化。陽性結果為綠色，陰性結果顯示為橙色。

1.2.5 LAMP擴增產物酶切分析

選取清晰的LAMP擴增產物條帶，依照試劑盒Alu I試驗說明，按總體積30 μL的體系進行酶切鑒定，在65 ℃條件下反應1 h，通過凝膠電泳法觀察酶切產物。

1.2.6 LAMP靈敏度分析

對馬肉進行模板DNA提取，使用無菌去離子水逐次進行10倍連續稀釋，其模板濃度分別為10～0.00001 ng/μL，取1 μL模板DNA，進行LAMP反應，產物通過熒光可視法分析，確定其靈敏度，且對該試驗進行重復驗證。并以行業標準SN/T 3730.5—2013實時熒光PCR法檢測方法為對照，評估LAMP方法的靈敏度。

1.2.7 阿膠及其保健食品中馬源性成分測定

通過優化好的LAMP方法對5種劑型的60個自制膠類及其保健食品樣品進行馬源性成分測定，樣品信息見表2，評估LAMP方法的準確性。

表2 自制膠類及其保健食品樣品 單位：個

1.2.8 LAMP實際應用與評估

為驗證LAMP方法對阿膠及其保健食品中馬源性成分的檢出情況，對市售50種樣品進行檢測，得到LAMP和行業標準SN/T 3730.5—2013實時熒光PCR法檢測數據。采用敏感性、特異性及符合率3個指標評價LAMP方法。按式（1）～（3）計算。

2 結果與分析

2.1 LAMP特異性分析

LAMP反應結束后，向反應體系中加入1 μL SYBR Green I熒光染料。結果如圖1所示，陽性結果顯示綠色（圖示為無色），陰性對照顯示橙色（圖示為黑色）。離心管1和2是含有馬源性成分的馬肉和馬騾肉，顯示綠色熒光（圖示為無色），離心管3～18是不含馬源性成分的肉樣，均顯示橙色（圖示為黑色）。由此可知，該引物具有良好的特異性。

圖1 LAMP反應的特異性檢測結果

2.2 LAMP擴增產物的酶切結果

限制性內切酶Alu I的酶切位點為AG/CT，該識別位點位于引物F1c上，通過理論計算可知，其酶切產物主要是由97 bp和60 bp的DNA片段組成。由圖2可知，由于60 bp的DNA片段較短，所以在凝膠電泳結果中條帶比較彌散，顯示不太明顯，而97 bp的DNA片段其凝膠電泳結果中條帶十分明顯。試驗表明LAMP擴增反應結果正確。

圖2 LAMP產物酶切結果

2.3 LAMP靈敏度分析

馬肉模板梯度稀釋后，各取1 μL模板DNA進行LAMP反應，在反應結束后向反應管中添加1 μL熒光染料SYBR Green I。反應結果如圖3所示，陽性結果顯示熒光綠色（圖示為無色），陰性對照顯示橙色（圖示為黑色），日光下肉眼可辨別。當模板濃度為10～0.0001 ng/μL時出現綠色熒光（圖示為無色），0.00001 ng/μL時出現橙色熒光（圖示為黑色），由此可知LAMP熒光可視法檢測馬源性成分的靈敏度是0.0001 ng/μL。

圖3 LAMP反應的靈敏度檢測結果

按照行業標準SN/T 3730.5—2013實時熒光PCR法檢測方法進行檢測，以滅菌的去離子水代替DNA模板，作為陰性對照。反應結果如圖4所示，Ct值如表3所示。當模板濃度為10～0.01 ng/μL時，均產生特異性擴增曲線，且各模板濃度的平均Ct值均小于35；然而當質量濃度為0.001～0.00001 ng/μL時，未產生擴增曲線，且各模板濃度的平均Ct值均大于40。因此，實時熒光PCR擴增反應的靈敏度是0.01 ng/μL。由此可知，LAMP法檢測的靈敏度為實時熒光PCR法的100倍。

表3 不同馬肉模板濃度的實時熒光PCR的Ct值

圖4 實時熒光PCR擴增反應的靈敏度

2.4 阿膠及其保健食品中馬源性成分測定

此次對5種劑型的60個自制膠類及其保健食品樣品進行馬源性成分檢測，測定結果見表4。結果顯示，只有以馬皮、馬騾皮為原料生產的產品中檢出馬源性成分，表明LAMP擴增方法準確性高。

表4 自制膠類及其保健食品樣品結果

2.5 實際樣品的檢測與 LAMP方法的評估

利用 LAMP和行業標準SN/T 3730.5—2013實時熒光PCR 2種方法檢測50種市售阿膠及其保健食品，結果如表5所示。

表5 LAMP方法評價

3 結論

試驗建立了可視化LAMP檢測阿膠及其保健食品中馬源性成分的方法，通過肉眼觀察顏色判斷檢測結果，操作方便簡單。針對馬的線粒體ATPase6基因設計特異性引物，進行特異性檢測。結果顯示，只有含馬源性成分的肉樣呈陽性，其他結果均顯示陰性，表明試驗設計的引物具有較好的特異性。使用行業標準SN/T 3730.5—2013實時熒光PCR法和LAMP法對50種實際樣品進行馬源性成分的檢測，并以SN/T 3730.5—2013法為參考對LAMP法進行評估，其敏感性為100%，特異性為97.67%，符合率為98.00%。可視化LAMP方法具有操作方便、特異性強、靈敏度高的特點，將為阿膠及其保健食品的健康發展提供有利保障。