SPE-HPLC-MS/MS測定水稻中氨基酸

李誠至，張慶，林鈺涓，于曉章

桂林理工大學環境科學與工程學院（桂林 541006）

在植物性食品中，水稻富含各種氨基酸，氨基酸精確含量涉及水稻的品質、口感、營養含量等，因此測定水稻中的氨基酸含量顯得至關重要[1-6]。傳統的植物組織中氨基酸分析，一般采用柱前衍生液相色譜法處理[7-11]。為此，人們研究了各種類型的衍生劑，由于基質不一樣，大部分衍生劑不能通用。而且衍生劑還存在價格昂貴，衍生效果差，容易損害色譜柱等缺陷[12-14]。另外，水稻中富含纖維素、蛋白質、有機酸、次生代謝產物等成分，這些化合物均干擾氨基酸的檢測[15-16]。

實際樣品分析中，我們發現有些氨基酸不穩定，特別是涉及抗逆功能的氨基酸極易被氧化還原，易造成分析結果的假陽性[6-7,17,19]。并且這些分析方法檢測氨基酸數量偏少，衍生劑普適性較差或者價格昂貴，難以滿足現實的需求。將HPLC的高效分離與串聯質譜MRM鑒定相結合，在分析復雜樣品時可以獲得較高的選擇性和靈敏度。基于固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法檢測水稻中氨基酸的研究也鮮見報道。此次試驗建立了固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜（SPE-HPLC-MS/MS）法測定水稻中的10種氨基酸，為水稻中氨基酸含量分析提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甲酸，Fluka；乙腈、甲醇，Merck；甲酸銨、所有氨基酸及其衍生物的標準品，Sigma-Aldrich。試驗用水均為Mili-Q Plus去離子水。

Agilent 1290 Infinity高液相色譜儀串聯 LC-5500 QTrap質譜儀（AB SCIEX）；渦旋混勻儀（美國MET VXT-200）；低溫高速離心機（Eppendorf 5430R）；色譜柱Zic-HILIC（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

分別稱取0.10 mg的異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸標準物質，用0.1%的HCl溶解并定容至100 mL，即配制成1.0 mg·L-1的氨基酸標準儲備溶液，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 樣品前處理

水稻由桂林市農業研究所提供。選取一定量的水稻，經過液氮冷凍處理，研磨后準確稱取，每份樣品50 mg。每份樣本中，先加入1 mL甲醇-乙腈-水溶液（2∶2∶1，V/V），渦旋混合均勻，低溫超聲30 min，在-20 ℃條件下孵育1 h沉淀蛋白，使用離心機在14000 r/min條件下離心20 min，取上清液。

固相萃取：用3.00 mL甲醇活化Waters Oasis Prime HLB小柱（Waters公司，USA）；提取液過柱，用4.00 mL乙腈-水溶液（50∶50，V/V）淋洗。收集洗脫液，氮吹近干。在進入質譜檢測分析時，加入100 μL乙腈-水溶液（1∶1，V/V）復溶，使用離心機在14000 r/min條件下離心20 min，然后進樣分析。

1.2.3 色譜條件

流動相：A液為25 mmol·L-1甲酸銨和0.08%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸-乙腈溶液。將樣品置于4 ℃自動進樣器中，柱溫為40 ℃，流速為0.25 mL·min-1，進樣量為2 μL。梯度洗脫程序設置：0～12 min，B液從90%線性變化至70%，A液相應地從10%線性變化至30%；12～18 min，B液從70%線性變化至50%，A液相應地從30%線性變化至50%；18～25 min，B液從50%線性變化至40%，A液相應地從50%線性變化至60%；25～30.1 min，B液從40%線性變化至90%，A液相應地從60%線性變化至10%；30.1～37 min，B液維持在90%，A液維持在10%。

1.2.4 質譜條件

采用5500 QTrap質譜儀（AB SCIEX）在正離子模式下進行質譜分析。采集模式：多反應監測（MRM）模式；5500 QTrap ESI源條件：離子源溫度500 ℃；離子源氣體1（Gas1）40；離子源氣體2（Gas2）40；簾氣（CUR）30；噴霧電壓（ISVF）5500 V；采用MRM模式檢測待測離子對。

1.3 統計分析

采用IBM SPSS 18.0和Microsoft office Excel 2010進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

氨基酸的檢測有采用正離子模式，也有采用負離子模式[13-14,17]。在負離子模式[ESI（-）]下，部分氨基酸產生了[M+COOH]-、[M+Cl]-的準分子離子峰。[M+Cl]-可能來源于水中氯離子影響，[M+COOH]-則是由于流動相中甲酸引起的。在正離子模式[ESI（+）]下，10種氨基酸均產生了較強的準分子離子峰[M+H]+，部分化合物也存在較弱的[M+Na]+加合峰。為提高方法靈敏度，試驗選擇正離子模式[ESI（+）]，以[M+H]+作為母離子，進行質譜其他參數的優化。再對母離子和子離子的裂解電壓和碰撞能量進行優化，以2個豐度最高的特征離子分別作為定量離子和定性離子，并對電噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、去簇電壓及碰撞電壓等參數進行優化，確定出最佳的質譜參數。所有氨基酸的質譜分析參數見表1。

表1 10種氨基酸的保留時間和質譜分析參數

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

試驗選擇了Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse AAA色譜柱（75 mm×4.6 mm，3.5 μm）和Zic-HILIC柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）進行考察。在二元流動相甲酸銨-甲酸水溶液-乙腈流動相下，對10種氨基酸分離條件進行了優化。由于很多氨基酸的水溶性較好，在C18柱和Eclipse AAA柱上的分離效果較差，其峰拖尾嚴重，不適合選用。鑒于此，最終選擇Zic-HILIC柱為色譜柱，并且在此基礎上，采用二元流動相進行梯度洗脫優化。

2.2.2 流動相的選擇

考察10種氨基酸在乙腈（0.1%甲酸）和水（0.1%甲酸）等流動相中的分離情況。結果發現，在正離子模式下，甲酸有利于促進分析物的質子化，增強目標物的質譜響應信號。因此，選擇25 mmol·L-1甲酸銨和0.08%甲酸水溶液為流動相A液，選擇0.1%甲酸-乙腈溶液為流動相B液。

鑒于上述化合物含有相同母核結構且極性差異較小，故考察幾種梯度洗脫程序對色譜分離的影響：（1）0 min，75% B；12 min，55% B；18 min，35% B；25 min，25% B；30.1 min，75% B；37 min，90% B；（2）0 min，80% B；12 min，60% B；18 min，40% B；25 min，30% B；30.1 min，70% B；37 min，90% B；（3）0 min，85% B；12 min，65% B；18 min，45% B；25 min，35% B；30.1 min，85% B；37 min，90% B；（5）0 min，90% B；12 min，70% B；18 min，50% B；25 min，40% B；30.1 min，90% B；37 min，90% B。最終確定梯度洗脫方案（5），大部分物質能在25 min內基本實現基線分離，且該分離條件用到揮發性的甲酸和甲酸銨改性劑，非常適合于質譜檢測。

2.3 標準曲線及檢出限

氨基酸標準儲備溶液用0.1%鹽酸水溶液稀釋配制成0.002，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00和2.00 μg·kg-1標準工作液系列。按照已經優化的色譜-質譜條件，對標準工作液系列進行分析。如表2所示，10種氨基酸線性范圍均在2.00×10-3～2.00 μg·kg-1之間，相關系數（R2）均大于0.9980，賴氨酸的檢出限最低至1.00×10-4μg·kg-1。

表2 10種氨基酸的線性方程、線性范圍、相關系數和檢出限

2.4 前處理方式的選擇

水稻中的異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，不同的提取方式對試驗結果有很大影響。以氨基酸標準儲備溶液為試驗對象，選擇了2種不同的方式。方式1：以10%乙醇作為提取劑，提取后離心，上清液上機檢測；方式2：樣品經固相萃取柱凈化，經過洗脫后上機檢測。試驗結果如圖1所示。

由圖1可以看出，經Waters Oasis Prime HLB固相萃取柱處理過的樣品液中干擾物明顯減少。這是由于SPE小柱中的材料對水稻中雜質有吸附作用，截留樣品中的雜質，對試驗的準確性和精確性有很大的提高；而以體積分數為10%乙醇沉淀水稻中的蛋白質，很難將樣品中的干擾物清除完全。因此，選擇Waters Oasis Prime HLB處理為前處理方式。

圖1 10種標準混合氨基酸的MRM色譜圖

2.5 固相萃取的優化

2.5.1 洗脫液的選擇

依據上述試驗結果，選用Waters Oasis Prime HLB固相萃取小柱對水稻中10種氨基酸進行凈化和富集。在對小柱的洗脫液方面，分別比較了體積分數為0，25%，50%，75%和100%的乙腈溶液的洗脫效果，結果以10種氨基酸的平均回收率為比較依據，結果如圖2所示。

從圖2可以看出，當乙腈體積分數為50%時，10種氨基酸平均回收率比較高，此時體積分數為50%乙腈的溶液洗脫能力較強，能較完全地洗脫氨基酸，所以試驗選擇體積分數為50%的乙腈溶液作為樣品的洗脫液。

圖2 洗脫液對10種氨基酸平均回收率的影響

2.5.2 洗脫液體積的選擇

在上述選用50%乙腈-水溶液作為Waters Oasis Prime HLB固相萃取柱洗脫液的基礎上，比較了洗脫液體積對10種氨基酸平均回收率的影響。試驗考察1，2，3，4和5 mL這5個體積對氨基酸洗脫效果的影響，結果如圖3所示。

從圖3可以看出，隨著洗脫液體積不斷增加，10種氨基酸平均回收率逐漸增加，但洗脫液體積達到4 mL以后再增加洗脫劑體積，回收率并沒有明顯增加，此時Waters Oasis Prime HLB固相萃取小柱中的氨基酸較完全地被洗脫出，再增加洗脫液體積，其對氨基酸回收率影響不大，所以選擇4 mL為洗脫體積較合適。

圖3 洗脫液體積對10種氨基酸平均回收率的影響

2.6 回收率和精密度

在處理過的水稻樣品中添加標準氨基酸混合溶液，配制成0.01，0.20和2.00 μg·kg-13個濃度加標水平的樣品，每個濃度設6個平行樣。用上述色譜-質譜聯用方法進行測定，平均回收率和相對標準偏差（SRSD）見表3。從表3可以看出，加標回收率在82.0%～118.2%之間，SRSD在3.2%～8.7%之間。

表3 10種氨基酸的回收率與相對標準偏差試驗結果（n=6）

2.7 實際樣品分析

用該方法分別對湘早秈45號、秈優63號、桂朝2號這3個品種水稻進行分析，每個樣品平行測定2次，測試結果具體見表4。從表4可以看出，除了谷氨酰胺在樣品中未檢出外，絕大部分樣品濃度范圍在0.908～ 9.970 μg·kg-1之間，其中脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸含量比較高；湘早秈45號水稻葉部樣品總離子流圖見圖4。

表4 水稻中10種氨基酸含量

圖4 水稻中氨基酸分析總離子流圖（湘早秈45號）

2.8 方法對比分析

將該方法所得的結果與GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》檢出限進行對比，結果如表5所示。從表5可以看出，此次研究建立的多種氨基酸測定方法的檢出限比大部分文獻中所報道的檢測方法檢出限低。另外，國家標準規定固體取樣量為2 g，該方法取樣量為50 mg，相對取樣量更小。

表5 氨基酸測定方法的檢出限對比

3 結論

此次試驗采用固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定水稻中的10種氨基酸（異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸），可在25 min內實現基線分離，較傳統的衍生-液相色譜法和氨基酸自動分析法極大縮短耗時[16-18]，氨基酸的檢測效率得到明顯提高，檢出限在1.00×10-4～6.40×10-4μg kg-1之間；加標回收率在82.0%～118.2%之間，SRSD在3.2%～8.7%之間。此外，該方法樣品前處理簡單，不需要添加衍生劑，可以避免由衍生化處理帶來的誤差，并且極大地縮短了分析時間，使得大樣本量分析更容易。將建立的方法用于湘早秈45號等3種水稻的氨基酸分析，成功地檢測到9種氨基酸。