八月瓜籽營養成分及對毛木耳菌絲生長的影響

鐘娟，梁光焰，汪建文，胡華林，孫超

1. 貴州師范學院生物科學學院（貴陽 550018）；2. 貴州醫科大學，省部共建藥物植物功效與利用國家重點實驗室/貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室（貴陽 550014）；3. 貴州科學院（貴陽 550001）

八月瓜（Akebia trifoliata）學名三葉木通，又稱羊開口、八月炸、野香蕉等，分布于海拔300～2100 m，氣候溫和濕潤的山林地帶，在我國貴州、云南、四川、湖南等地都有生長，其中以貴州銅仁、云南昭通、四川雅安、湖南張家界居多[1]。八月瓜是一種營養豐富食藥兩用水果，富含礦物元素、三萜類皂苷、維生素C、氨基酸、甾醇、有機酸、可溶性糖等[2-5]，素有“保健果王”之稱。八月瓜中藥名為預知子，具有抗菌消炎、活血止痛、抗腫瘤、抗抑郁等功能[6-8]。

八月瓜肉質鮮嫩、甘甜可口，但其種籽較多，平均含籽約200顆/果。對八月瓜籽的脂肪酸、氨基酸成分及抗氧化、抗腫瘤活性等已開展研究。周瑜等[9]研究發現不同種源預知子籽油的脂肪酸組成及含量存在差異。歐陽玉祝等[10]用氣相色譜-質譜聯用儀（GCMS）測定八月瓜籽油脂肪酸組成與含量，結果發現其主要為油酸（40.93%）和棕櫚酸（30.08%）。謝小霞等[11]和彭滌非等[12]在研究長江流域地區預知子籽油的脂肪酸組成時發現預知子籽油具備開發成新的營養保健油的潛力。史卿等[13]從八月瓜籽中獲得含17種氨基酸的蛋白質。歐陽玉祝等[10]比較八月瓜籽油與VE、異VC-Na、BHT和芝麻油的自由基清除能力，結果表明八月瓜籽油的還原能力、H2O2和超氧陰離子自由基清除能力最強。Lu等[14]和任紅艷等[15]研究表明八月瓜提取物對抑制肝癌細胞增長具有顯著功效，尤其是八月瓜籽。然而，針對黔產八月瓜籽的營養成分、化學組成等鮮有報道，特別是，還未見八月瓜籽油在農業領域的應用。

毛木耳營養豐富，味美可口，具有抗癌、清肺、益氣、止痛活血等功效。因此，試驗以黔中引種八月瓜籽為原料，采用超聲提取法提取籽油，全自動氨基酸分析儀測定游離氨基酸的種類及質量分數，GC-MS法測定揮發性物質的化學組成，進而探究八月瓜籽油及其揮發性成分對毛木耳菌絲生長的影響，以期為八月瓜籽油的應用拓寬領域，進而為八月瓜籽資源的綜合利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

八月瓜籽（龍里縣恒遠生態農業專業合作社）；毛木耳菌種（貴州省生物研究所）；棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、硬脂酸甲酯（上海麥克林生化科技有限公司）；PDA培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）；氨基酸混合標準液、檸檬酸-檸檬酸鋰緩沖液的氫氧化鋰再生液（德國Sykam公司）。

1.2 主要儀器與設備

HP6890/5975C型GC-MS聯用儀（Agilent）；HP-5MS型彈性石英毛細管柱（Agilent）；S433D型全自動氨基酸分析儀，LCAK 06/Na型陽離子分析（Sykam）；AG 285型十萬分之一天平（Mettler Toledo）；Millipore-0026型超純水（Millipore）；N-1100型旋轉蒸發儀（Eyela）；微量移液槍（Sartorius）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；DL SB-5/20型低溫冷卻液循環泵（鄭州長城科工貿有限公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 八月瓜籽油的制備

參照楊輝等[16]的八月瓜籽油超聲提取法而稍作修改。準確稱取15.00 g干燥八月瓜籽粉末于250 mL錐形瓶中，加入料液比1∶11（g/mL）的石油醚為提取溶劑，在超聲功率60%，溫度60 ℃下超聲50 min，超聲提取3次，每次間隔30 min，抽濾，濾液用旋轉蒸發儀減壓濃縮后得八月瓜籽油，按式（1）計算出油率，試驗3次取出油率平均值為42.39%。

式中：y為出油率，%；m1為樣品中油質量，g；m2為八月瓜籽粉末質量，g。

1.3.2 八月瓜籽油的甲酯化

參考歐陽玉祝等[17]所述甲酯化法進行。將0.5 g籽油置于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL濃硫酸-甲醇溶液（1∶99，V/V），在水浴鍋上70 ℃加熱回流60 min后，加入10 mL正己烷和20 mL蒸餾水，搖勻靜置，取上清液，添加無水硫酸鈉干燥，即得待用。

1.3.3 游離氨基酸的測定

供試品溶液制備：分別稱取3.00 g去油前后八月瓜籽粉末置100 mL量瓶中，加入濃度為0.02 mol/L鹽酸30 mL，攪拌15 min，靜置20 min，按4000 r/min離心10 min，上清液置于100 mL量瓶中，殘渣加25 mL水攪拌3min，離心，重復2次，合并上清液定容于100 mL，過0.45 μm有機微孔濾膜，即得。

色譜條件：色譜柱為LCAK07/Li型標準分析陽離子型交換樹脂；雙通道檢測波長，其中440 nm通道檢測脯氨酸，570 nm通道檢測其他所有氨基酸；輸液泵壓力范圍0～4.2 MPa；洗脫泵流速0.45 mL/min，茚三酮衍生泵流速0.25 mL/min；進樣量50 μL；分離柱溫度37 ℃，反應器溫度130 ℃。

標準溶液的配制、梯度洗脫條件等可參照文獻[18]。記錄各色譜峰面積，計算八月瓜籽油各游離氨基酸質量分數。

1.3.4 GC-MS分析

采用GC-MS法分析八月瓜籽油揮發性物質的化學組成。

GC條件：色譜柱為ZB-5MSI型彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 μm×250 μm）。柱溫于48 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至206 ℃，以10 ℃/min升至310 ℃，運行58 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為氦氣（99.999%），載氣流量1.0 mL/min，按分流比20∶1進樣，溶劑延遲時間4.0 min。

MS條件：離子源為EI源，溫度230 ℃；電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，倍增器電壓1482 V，發射電流34.6 μA，質量范圍29～500 amu。

甲酯化八月瓜籽油樣品用正己烷稀釋，取1 μL溶液進樣。各峰與標準圖譜庫Nist05和Wiley275比對，確定其揮發性物質的組成，用峰面積歸一化法計算各揮發性物質化學組成成分的相對質量分數。

1.3.5 生物活性評價

1.3.5.1 供試藥劑溶液配備

將八月瓜籽油及其主要揮發性成分溶于無菌水中，加入與藥劑等體積的吐溫-80配制成“母液”，根據各藥劑的試驗需求進一步稀釋。試驗使用藥劑質量濃度范圍分別為0.2000～0.0125μg/mL（液體）和1.000～0.0625 μg/mL（固體）。

1.3.5.2 菌種的活化

選取無污染的毛木耳菌種于超凈工作臺中接種菌絲至含PDA培養基的培養皿中，倒置于相對濕度60%～65%、溫度24±51 ℃，光周期L∶D=12 h∶12 h的培養箱中培養，重復3次，待菌絲即將長滿整個培養皿時終止培養，備用。

1.3.5.3 含藥PDA培養基的制備

待PDA培養基冷卻至45～50 ℃時，用移液槍于超凈工作臺中吸取一定量的1.3.5.1溶液，加入培養基中，搖勻后直接倒入直徑9 cm的培養皿中，每個藥劑5個濃度，每皿20 mL，靜置冷卻，備用。

1.3.5.4 生物活性測定

選取生長均一、正圓形的菌落，用打孔器在超凈工作臺中沿邊緣順序打成直徑r為7 mm的菌碟，用接種環挑取菌碟接入1.3.5.3所述培養基中央，重復3次，對照為加入吐溫-80無菌水的PDA培養基。倒置于24±1 ℃培養箱中培養，每隔24 h觀察菌絲生長情況，并采用十字垂直交叉法通過游標卡尺測定菌落直徑R，待任何一組菌絲生長到接近培養皿邊緣時即終止培養。

1.4 數據處理

菌絲純生長量、菌絲抑制率和生長速率按式（2）計算。

采用SPSS 19.0統計軟件中的One-way ANOVA進行處理，并運用LSD法對各處理及對照進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 游離氨基酸分析

八月瓜籽去油前后各游離氨基酸檢測數據見表1。未去油八月瓜籽中含有氨基酸27種，其中γ-氨基丁酸質量分數最高，其次是精氨酸；總氨基酸質量分數（T）為0.1802%，其中必需氨基酸質量分數（E）為0.0562%，E/T比值達31.19%；人體必需氨基酸達8種，早產兒必需氨基酸4種，分別為精氨酸、牛磺酸、胱氨酸、酪氨酸；小兒生長發育期間的必需氨基酸1種，即組氨酸。

表1 八月瓜籽去油前后游離氨基酸檢測結果

去油后八月瓜籽中含有氨基酸28種，其中γ-氨基丁酸質量分數最高，其次是精氨酸；T為0.4737%，高于八月瓜果皮和果肉[4]，其中E為0.1264%，E/T比值達26.68%；與去油前八月瓜籽中人體必需氨基酸、早產兒必需氨基酸和小兒生長發育期間的必需氨基酸種類完全一致，具有巨大資源再利用價值。

表2為八月瓜籽中味覺氨基酸組成及質量分數檢測結果。由表2可知，未去油八月瓜籽中甜味氨基酸[19]質量分數為0.0390%，其中丙氨酸質量分數最高，為0.0258%；藥用氨基酸[20]質量分數為0.0895%，其中精氨酸質量分數最高，為0.0299%；鮮味氨基酸[21]質量分數為0.0625%，芳香味氨基酸[22]質量分數為0.0189%。去油后八月瓜籽中甜味氨基酸質量分數為0.0843%，其中丙氨酸質量分數最高，為0.0499%；藥用氨基酸質量分數為0.1947%，與八月瓜果皮基本一致[4]，其中精氨酸質量分數最高，為0.0589%；鮮味氨基酸質量分數為0.1395%，芳香味氨基酸質量分數為0.0310%。

表2 八月瓜籽中味覺氨基酸的組成及質量分數

2.2 揮發性物質的化學組成

甲酯化八月瓜籽油揮發性物質化學組成的總離子流圖見圖1，化學組成分析結果見表3。甲酯化八月瓜籽油中共檢測出8種揮發性物質，其相對質量分數占總離子峰的99.58%，其中反亞油酸甲酯相對質量分數最高，為27.45%，其次是7-十八烯酸甲酯（27.42%），棕櫚酸甲酯、油酸甲酯和硬脂酸甲酯的相對質量分數依次為21.86%，17.43%和3.75%，這5種揮發物的質量分數占總離子峰的97.91%，是甲酯化八月瓜籽油中的主要揮發性物質。

表3 揮發性物質的化學組成分析結果

圖1 甲酯化八月瓜籽油揮發性物質化學組成的總離子流圖

2.3 4種藥劑對毛木耳菌絲生長的影響

利用甲酯化八月瓜籽油揮發性物質化學組成分析結果，選取相對質量分數高、市場易得的3種主要揮發性物質和八月瓜籽油對毛木耳菌絲生長進行生物活性評價。

2.3.1 4種藥劑對毛木耳菌絲的抑制作用

由表4可知，在預設藥劑濃度范圍內，八月瓜籽油（質量濃度為0.025～0.100 μL/mL）對毛木耳菌絲生長有一定的抑制作用，最大抑制率為15.03%，而高或低濃度均對菌絲生長有促進作用，低濃度促進率為9.8%，高于高濃度的1.97%；油酸甲酯和硬脂酸甲酯在預設濃度內均對菌絲生長有抑制作用，且硬脂酸甲酯在0.125 μg/mL濃度下有最大抑制率，其值為23.96%；棕櫚酸甲酯在預設濃度內則體現高濃度促進低濃度抑制菌絲生長的作用。

表4 4種藥劑對毛木耳菌絲的抑制作用

2.3.2 4種藥劑對毛木耳菌絲生長速率的影響

由表5可知，在預設藥劑濃度范圍內，培養基中添加八月瓜籽油對毛木耳的生長具有一定的抑制作用，與對照相比，其質量濃度為0.100和0.050 μg/mL時可顯著影響菌絲生長；油酸甲酯和硬脂酸甲酯在預設濃度內均可抑制菌絲的生長，其中油酸甲酯各濃度對菌絲生長影響不顯著，但硬脂酸甲酯0.125 μg/mL質量濃度下生長速率最小，其值為4.06±0.07 mm/d，與對照相比影響顯著；棕櫚酸甲酯在預設濃度內則表現高濃度促進低濃度抑制菌絲的生長，其低濃度生長速率與對照相比表現出顯著的抑制性。

表5 4種藥劑對毛木耳菌絲生長速率的影響

3 結論

氨基酸是構成蛋白質的基本物質，可通過代謝合成抗體、激素和肌酸等人體必需物質；脂肪酸是機體主要能量來源之一，可幫助人體活動補充必要的營養物質。八月瓜籽中不飽和脂肪酸含量較高，氨基酸種類豐富、含量較高，尤其是人體必需氨基酸和藥用氨基酸，被廣泛應用于在醫藥、保健品、食品等領域，具有很高的開發利用價值。

試驗以黔中引種八月瓜籽為原料，采用超聲提取法提取籽油，全自動氨基酸分析儀測定游離氨基酸的種類及質量分數，GC-MS法測定揮發性物質的化學組成，進而探究八月瓜籽油及其揮發性成分對毛木耳菌絲生長的影響。結果表明，去油后八月瓜籽含有28種氨基酸，總氨基酸質量分數（T）為0.4737%，其中8種必需氨基酸總量（E）為0.1264%，E/T比值達26.68%；鮮味、甜味、芳香味和藥用氨基酸質量分數分別為0.1395%，0.0843%，0.0310%和0.1947%。甲酯化八月瓜籽油共檢測出8種揮發性物質，其中反亞油酸甲酯質量分數最高，其次是7-十八烯酸甲酯。4種藥劑中，以棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯對毛木耳菌絲生長的影響最大，其在0.1250 μg/mL質量濃度下，抑制率和生長速率均有最小值，且與對照相比影響顯著。試驗結果可為八月瓜籽榨油后殘渣資源再利用、籽油綜合開發利用提供數據支撐。