酸棗仁蛋白組分的分離提取及亞基分析

張紅印，韓榮欣，肖鳳琴，王海東，嚴銘銘, ，趙大慶

1. 長春中醫藥大學（長春 130117）；2. 吉林省中藥保健食品科技創新中心（長春 130117）

中藥酸棗仁始載于《神農本草經》，是中國傳統常用中藥，其來源為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill. var.spinosa（Bunge）Hue x H. F. Chou的干燥成熟種子[1]，收錄于2002年頒發的《既是食品又是藥品的物品名單》。迄今為止，在酸棗仁中鑒定出化合物150余種，包括萜類、生物堿、類黃酮、脂肪酸、揮發油、多糖等。藥理試驗研究表明，酸棗仁提取物和純化的化合物都具有良好的生物活性，特別是鎮靜催眠的作用[2-3]。

作為種子類藥材，酸棗仁含有豐富的天然蛋白質資源，蛋白含量占27%以上。酸棗仁蛋白含有18種常見氨基酸，人體必需氨基酸含量占總氨基酸的23.60%，其中色氨酸含量最豐富，非必需氨基酸中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的30.95%，表明酸棗仁蛋白是一種開發潛力很高的優質蛋白[4-5]。對于酸棗仁組分蛋白的研究尚未報道，表明對于酸棗仁蛋白質資源并未充分利用，因此，驗證和探討酸棗仁蛋白質的結構組成，能夠更有效合理利用酸棗仁資源，提高產業價值。

試驗以酸棗仁脫脂粉為原料，以不同組分蛋白的提取率為考察指標，通過比較不同蛋白提取條件，確定各組分蛋白的最佳提取工藝，對所得的組分蛋白進行亞基組成分析，為酸棗仁藥材在藥食同源的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不同批次酸棗仁樣品（長春中醫藥大學附屬醫院）。

1.2 試驗試劑

考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白、甘油、十二烷基硫酸鈉、巰基乙醇、溴酚藍、丙烯酰胺、APS、Tris、氨基乙酸、低分子量蛋白質Marker（北京索萊寶科技有限公司）；石油醚、無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸、磷酸、尿素、甲醇等（均為分析級試劑）。

1.3 設備與儀器

Sigma微型離心機（德國Sigma有限公司）；UV-1700紫外分光光度計[日本島津（中國）有限公司]；電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]；HH-6數顯恒溫水浴鍋（金壇市佳美儀器有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀（美國Bio-Rad公司）；低溫離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；SCIENTZ-50F冷凍干燥機（寧波新芝凍干設備股份有限公司）。

1.4 脫脂酸棗仁粉制備

將酸棗仁進行粉碎，過四號篩，得酸棗仁粉。將所得酸棗仁粉按照料液比1∶5（g/mL）加入石油醚，在室溫下攪拌12 h，以5000 r/min離心10 min，收集沉淀，重復操作1次，將所得沉淀置于通風櫥內，待石油醚揮發干凈后，將脫脂粉收集備用。

1.5 酸棗仁蛋白分級提取

采用Osborne分級分離方法[6]對酸棗仁蛋白進行分離。

1.5.1 清蛋白提取

取一定量脫脂酸棗仁粉，按照料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，在25，35，45和55 ℃溫度條件下分別攪拌1，2，3和4 h，以70000 r/min離心10 min，取上清液，透析，冷凍干燥。

1.5.2 球蛋白的提取

將清蛋白提取后的沉淀，按照料液比1∶10（g/mL），加入1%，2%，3%，4%，5%和6% NaCl溶液，分別攪拌1，2，3和4 h，離心后取上清液，即為球蛋白溶液，透析，冷凍干燥。

1.5.3 醇溶蛋白的提取

將球蛋白提取后的沉淀，按照料液比1∶10（g/mL），加入50%，60%，70%和80%乙醇溶液，分別攪拌1，2，3和4 h，離心后取上清液，即為醇溶蛋白溶液，透析，冷凍干燥。

1.5.4 谷蛋白的提取

將醇溶蛋白提取后的沉淀，按料液比1∶10（g/mL），加入0.01，0.05，0.10和0.15 mol/L的NaOH溶液，分別攪拌1，2，3和4 h，離心后取上清液，即為谷蛋白溶液，透析，冷凍干燥。

1.6 蛋白溶液濃度測定

采用考馬斯亮藍比色法[7]測定。

1.7 組分蛋白提取率及化學組成分析

1.7.1 各組分蛋白提取率計算

對最佳提取工藝下獲得的酸棗仁組分蛋白進行蛋白定量測定，結果見表2。

1.7.2 各組分蛋白化學組成分析

對最佳提取工藝下獲得的酸棗仁組分蛋白進行化學組成分析。水分的測定參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》的直接干燥法；蛋白的測定參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》的凱氏定氮法；脂肪的測定參照GB/T 5009.6—2006《食品中脂肪的測定》的索式抽提法；灰分的測定參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》的質量法。

1.8 酸棗仁蛋白組分SDA-PAGE電泳

參考Laemmli[8]的方法。將冷凍干燥的組分蛋白粉與上樣緩沖液，按1∶1的比例混合。將混合物置于沸水中加熱3～5 min，待溫度降至室溫后，進行上樣。濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%，樣品上樣量10 μL。恒壓電泳，濃縮膠電壓70 V，時間30 min，分離膠電壓140 V，時間60 min。電泳結束后，采用考馬斯亮藍（R250）染色30 min，脫色后，Invitrogen iBright FL 1000（美國賽默飛世爾科學公司）掃描成像。

1.9 統計分析

所有試驗都重復3次后取平均值，試驗數據為平均值±標準差，采用Origin 9.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酸棗仁蛋白脫脂工藝的考察

對不同批次酸棗仁藥材進行粉碎后，對石油醚脫脂效率進行考察（表1），結果表明，酸棗仁藥材脫脂效率穩定，但小于索氏提取法[9]，由于操作簡便、脫脂量大，以石油醚為脫脂溶劑可回收再利用，因此更適用于工業生產。

表1 不同批次酸棗仁粉石油醚脫脂效率考察

2.2 單因素考察結果

2.2.1 不同溫度對酸棗仁清蛋白提取的影響

由圖1可知，隨著提取時間增加，清蛋白提取率逐漸增長，在45 ℃條件下提取率達到最大值。溫度是影響蛋白質溶解度的主要物理因素之一，在一定溫度范圍內，蛋白質的溶解度隨著溫度增加而增大，其主要原因是溫度能夠使蛋白質空間結構發生改變，發生變性反應，蛋白質分子結構展開，分散性增加，有利于酸棗仁清蛋白質溶出，提高提取效率[10-12]。但在55 ℃條件下，酸棗仁清蛋白的提取率隨提取時間增加呈下降趨勢，表明提取溫度過高會破壞蛋白的主要結構，會導致蛋白質變性沉淀。

圖1 不同溫度對酸棗仁清蛋白濃度的影響

2.2.2 不同NaCl溶液濃度對酸棗仁球蛋白提取的影響

由圖2可知，在NaCl濃度1%～6%范圍內，隨著NaCL濃度增加，酸棗仁球蛋白隨著時間增加提取率逐漸增大；NaCl濃度5%時，蛋白提取率最高。鹽濃度繼續增加到6%時，蛋白質提取率隨著時間增長有所降低。原因主要是溶液中的鹽離子會影響蛋白質分子之間的靜電吸引和排斥相互作用，在低濃度鹽溶液中，由于鹽溶效應，離子強度增加，蛋白質分子與水分子之間的相互作用增強，蛋白質的溶解度會增加，但濃度達到一定水平時，帶電蛋白質分子表面電荷逐漸減少，導致分子間排斥相互作用會隨著溶液離子強度增加而降低[13-14]。

圖2 不同NaCl溶液濃度對酸棗仁球蛋白濃度的影響

2.2.3 不同乙醇溶液體積分數對酸棗仁醇溶蛋白提取的影響

有機溶劑能夠改變蛋白質的疏水作用、氫鍵和靜電相互作用的穩定性，極易引起蛋白質變性沉淀，主要是由于有機溶劑能夠降低水的介電常數，導致蛋白質之間的靜電斥力降低。醇溶蛋白結構較為特殊，含有大量疏水性氨基酸和含硫氨基酸，使其具有獨特的結構和功能特性，如良好的成膜性、彈性和疏水性等[15]。由圖3可知，隨著提取時間增加，醇溶蛋白質提取率多呈增大趨勢。隨著乙醇體積分數提高，醇溶蛋白提取率增加，乙醇體積分數70%時，醇溶蛋白提取率達到最大值，表明此時酸棗仁醇溶蛋白與醇溶液之間的相互作用到達穩定狀態，乙醇溶液體積分數80%時，隨著提取時間增加，蛋白發生變性導致沉淀，溶解度降低。

圖3 不同乙醇溶液體積分數對酸棗仁醇溶蛋白濃度的影響

2.2.4 不同NaOH溶液濃度對谷蛋白提取的影響

由圖4可知，隨著NaOH濃度逐漸增加，谷蛋白提取率逐漸增加。NaOH濃度0.1 mol/L時，谷蛋白提取率達到最大值。在堿性環境下，隨堿溶液濃度增高，蛋白空間結構會發生改變，二硫鍵發生斷裂，導致疏水性降低，從而增加蛋白質溶解度。

圖4 不同NaOH溶液濃度對酸棗仁谷蛋白濃度的影響

2.3 組分蛋白提取率及化學組成分析

對酸棗仁脫脂粉及提取凍干后的蛋白粉末進行化學組成分析，結果如表2所示。酸棗仁脫脂粉中最主要的成分是蛋白質，達到55.17%。采用最佳提取工藝提取的組分蛋白，其蛋白提取率分別為清蛋白13.24%、球蛋白22.25%、醇溶蛋白1.35%、谷蛋白13.57%，且4種酸棗仁組分蛋白的蛋白質量分數均在80%以上，其中球蛋白質量分數最高，達到88.69%；酸棗仁蛋白的粗脂肪質量分數均低于2%，其中球蛋白的粗脂肪質量分數低至0.72%，說明該方法能較為有效地分離蛋白質和其他雜質；清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的灰分分別為1.89%，1.21%，1.05%和1.45%，表明經過透析后，蛋白提取液中的鹽離子能較大程度地被除去。化學組成分析結果表明四步分離法能對酸棗仁蛋白進行初步分離提純，得到純度較高的酸棗仁蛋白各組分。

表2 酸棗仁組分蛋白化學組成的比較 單位：%

2.4 酸棗仁蛋白組分電泳分析

由圖5和圖6可知，在不同溫度條件下酸棗仁清蛋白亞基組成有較大區別。在45 ℃條件下，亞基條帶較多，說明此條件下對清蛋白的各亞基組分均有較好的提取率。清蛋白的亞基分布在相對分子質量1～55 kDa。此外，添加β-巰基乙醇后，清蛋白的亞基條帶增多，說明清蛋白含有二硫鍵。在不同鹽濃度條件下，提取所得酸棗仁球蛋白在電泳圖譜中均呈現相同的亞基條帶，這說明鹽濃度對球蛋白的提取率有較大影響，但對亞基組成的影響較小，相對分子質量主要分布在10～25 kDa。由于β-巰基乙醇添加前后，球蛋白亞基條帶有較大變化，推測球蛋白中也含有二硫鍵。在質量分數5% NaCl溶液中，球蛋白提取率最高，出現的條帶顏色深。圖5中分布在相對分子質量35 kDa左右的球蛋白亞基，在還原劑的存在下，二硫鍵斷裂，遷移率變大，大部分分布在14～25 kDa之間。在不同醇濃度條件下，未見醇溶蛋白條帶，還原前后的電泳條帶也未有變化，表明醇溶蛋白較少，或者醇溶蛋白未能進入分離膠中。酸棗仁谷蛋白亞基主要分布于15～55 kDa，堿濃度對酸棗仁谷蛋白亞基組成有較大影響，濃度0.1 mol/L時條帶明顯。圖6中分布在相對分子質量25～55 kDa的谷蛋白亞基，在還原劑存在下，二硫鍵斷裂，遷移率變大，大部分分布在15～25 kDa。通過比較圖5與圖6，谷蛋白在25～55 kDa的亞基可能是通過二硫鍵交聯形成的。

圖5 還原性酸棗仁組分蛋白SDS-PAGE結果

圖6 非還原性酸棗仁組分蛋白SDS-PAGE結果

3 結論

基于Osborne分級提取法對酸棗仁組分蛋白進行分級提取，通過單因素考察對各提取影響因素進行優化，優化后確定各組分蛋白最佳提取工藝條件：清蛋白提取最佳溫度為45 ℃，球蛋白提取最佳鹽濃度為5%，醇溶蛋白提取的最佳醇濃度為70%，谷蛋白提取最佳堿濃度為0.1 mol/L；針對最佳工藝獲得的組分蛋白，其蛋白提取率的大小為球蛋白＞谷蛋白＞清蛋白＞醇溶蛋白，化學組成分析表明各組分蛋白質量分數均在80%以上，表明此提取方法是準確可行的。酸棗仁清蛋白和球蛋白的亞基主要分布在相對分子質量10～55 kDa，分布在25～55 kDa的清蛋白、球蛋白和谷蛋白亞基可能是通過二硫鍵作用形成的。酸棗仁醇溶蛋白可能是大分子蛋白，還原性與非還原性電泳未檢測到其明顯條帶。此外，清蛋白包含酸棗仁蛋白中的大部分亞基，從營養學角度分析，其營養更為均衡。綜上所述，不同提取條件對酸棗仁蛋白的提取率有較大影響，且在一定程度上影響蛋白亞基組成。