響應(yīng)曲面設(shè)計優(yōu)化牛初乳中乳鐵蛋白的超濾提取工藝

劉佳欣，賀夢瑤，朱建星，張萬忠

沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院（沈陽 110142）

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，相對分子質(zhì)量約為80 kDa[1]，最早是由Sorensen（1939）在牛乳中一個未知的“紅色組分”中發(fā)現(xiàn)的[2]。乳鐵蛋白在乳中的含量最為豐富，特別是在初乳中含量較高，人初乳中乳鐵蛋白的質(zhì)量濃度可達到7 mg/mL，牛初乳中乳鐵蛋白的質(zhì)量濃度平均為1 mg/mL[3]。乳鐵蛋白作為多功能糖蛋白具有多種生物活性，如抗病毒、抗癌、抗氧化、調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)[4]，還具有抑菌功能，對腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)作用[5]。

超濾是一種基本的膜分離技術(shù)，其原理是根據(jù)不同的膜孔徑，分離出不同分子質(zhì)量和形狀的大分子物質(zhì)。超濾操作簡便，易于形成大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[6-7]。試驗采用超濾膜截留相對分子質(zhì)量100 kDa的裝置，首先對膜通量和膜效率的單因素（料液溫度、操作壓力、料液pH）進行優(yōu)化，在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)曲面法（RSM），借助實驗設(shè)計軟件（Design-Expert version 8.0.6），以膜通量為響應(yīng)值，對超濾提取牛初乳中乳鐵蛋白的工藝進行優(yōu)化，以得到最佳的提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛初乳，丹東振興區(qū)奶戶提供；95%乳鐵蛋白，Biotopped公司；鹽酸，無錫市亞盛化工有限公司；pH精密試紙，沈陽富陽特種紙業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

小型切向流超濾裝置，美國Millipore公司；PelliconXL裝置，美國Millipore公司；高速冷凍離心機，株式會社日立制作所；HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；FA2204B型電子精密天平，天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將牛初乳裝入100 mL離心管中，以10000 r/min 4 ℃離心30 min，除去上層脂肪；加入1 mol/L的稀鹽酸，緩慢添加調(diào)至牛初乳溶液pH 4.6，水浴加熱40 ℃，保溫30 min，然后放入高速冷凍離心機中，以10000 r/min 40 ℃離心30 min，保留上層乳清蛋白，得到乳清蛋白溶液；進行抽濾，得到的粗樣品用0.45 μm的微孔濾膜過濾，得到純凈的樣品。

1.3.2 超濾

準(zhǔn)確量取100 mL樣品溶液，加入100 mL經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾的蒸餾水，按1∶1稀釋，倒入料液缸中，采用規(guī)格為100 kDa的PelliconXL裝置，進行超濾試驗，收集透過液，測定膜通量和乳鐵蛋白含量，計算膜效能。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白溶液的配制

精確稱取0.01 g純度為95%的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，用0.15 mol/L NaCl溶液定容至100 mL，配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白溶液。選用0.22 μm的微孔濾膜過濾。

1.3.4 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取9支試管，分別加入0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0和8.0 mL的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度為100 μg/mL），用0.15 mol/L NaCl溶液補足到10 mL，混合均勻，30 min內(nèi)以0管為空白對照，以不同質(zhì)量濃度的乳鐵蛋白為橫坐標(biāo)，475 nm處的乳鐵蛋白吸光度為縱坐標(biāo)，繪制乳鐵蛋白吸收度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 計算方法

1.4.1 膜通量的計算

膜通量：單位時間透過單位膜面積的滲透液流量。按式（1）計算。

式中：JW為膜通量，L/（m2·h）；V為透過液總體積，L；A為膜有效面積，m2；t為過濾時間，h。

1.4.2 膜效能的計算

膜效能：單位時間內(nèi)透過單位膜面積的乳鐵蛋白質(zhì)量。按式（2）計算。

式中：Me為膜效能，g/（m2·min）；m為透過液中質(zhì)量，g；A為膜面積，m2；t為時間，min。

1.5 單因素試驗

單因素試驗以料液溫度25 ℃、操作壓力0.25 MPa、料液pH 7為基本條件，通過改變單一因素來探討其對膜通量和膜效能的影響。料液溫度25，30，35，40，45和50 ℃；操作壓力0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 MPa；料液pH 4，5，6，7和8。

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，采用Design-Expert軟件，以膜通量為影響值進行響應(yīng)面優(yōu)化，響應(yīng)面因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素和水平表

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗設(shè)置3次重復(fù)，并通過SPSS 17.0軟件統(tǒng)計進行數(shù)據(jù)方差分析，p＜0.01表示差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，試驗結(jié)果用作圖軟件Origin 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

乳鐵蛋白吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。乳鐵蛋白吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.00898x+0.28363，R2=0.9995。

圖1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 料液溫度對膜通量和膜效能的影響

由圖2可知，當(dāng)料液溫度升高時，膜通量和膜效能也隨之升高。當(dāng)料液溫度為35 ℃時，膜通量達到最大值。這是因為蛋白質(zhì)的熱變性受溫度的影響，導(dǎo)致溶解度發(fā)生變化，從而使膜通量隨溫度的升高而增加。當(dāng)溫度大于35 ℃時，膜通量和膜效能開始下降，這是因為加熱之后乳清蛋白的穩(wěn)定性降低，甚至發(fā)生蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)沉淀下來，不能透過超濾膜，超濾膜產(chǎn)生堵塞，從而導(dǎo)致膜通量降低，乳鐵蛋白的含量降低，因此導(dǎo)致膜效能降低[9]。

圖2 料液溫度對膜通量和膜效能的影響

2.2.2 操作壓力對膜通量和膜效能的影響

由圖3可知，當(dāng)操作壓力不斷增大時，膜通量也隨之增大，膜效能呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)操作壓力為0.25 MPa時，膜效能達到最大值。 根據(jù)速率衰減模型解釋說明，當(dāng)壓力較低時，超濾膜的阻力、黏度都處于恒定狀態(tài)，膜通量的大小與壓力呈正相關(guān)；當(dāng)操作壓力超過0.25 MPa之后，膜通量增長緩慢，基本保持不變，根據(jù)凝膠層阻力模型和濃差極化進行解釋說明，由于超濾膜污染嚴(yán)重，蛋白質(zhì)分子能在膜之間形成一定的阻力，導(dǎo)致溶液中的其他分子不能通過超濾膜，因此膜通量和膜效能 的大小發(fā)生改變[10]。

圖3 操作壓力對膜通量和膜效能的影響

2.2.3 pH對膜通量和膜效能的影響

由圖4可知，隨著料液pH的大小逐漸升高，膜通量和膜效能的變化為先下降后先上升，最后下降。當(dāng)料液pH為5時，膜通量和膜效能都處于最低狀態(tài)，這是因為乳清蛋白的等電點大多分布在pH 5.0左右，如α-乳白蛋白等電點在4.8左右，β-乳球蛋白等電點在5.1～5.3之間。此時蛋白質(zhì)荷電性和溶解度最低，乳清蛋白易于發(fā)生聚集，在超濾膜表面和膜孔內(nèi)沉積，膜孔堵塞，導(dǎo)致大量乳鐵蛋白被截留，因此膜通量和膜效能降低[11]。當(dāng)料液pH 7時，膜通量和膜效能達到最大值。當(dāng)pH繼續(xù)升高，達到8時，膜通量和膜效能開始下降，原因可能是溶液環(huán)境達到乳鐵蛋白等電點，乳鐵蛋白容易形成沉淀，不能通過超濾膜，超濾膜產(chǎn)生堵塞，導(dǎo)致膜通量降低，乳鐵蛋白的含量降低，從而導(dǎo)致膜效能下降[12]。

圖4 料液pH對膜通量和膜效能的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 回歸模型的構(gòu)建及方差分析

膜通量提取試驗設(shè)計方案以及結(jié)果見表2，回歸方差分析見表3。擬合所得的多元二次回歸方程為Y= 7.42+0.14A+0.35B-0.012C-0.025AB-0.10AC+0.13BC-0.41A2-0.34B2-0.21C2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計和試驗結(jié)果

由表3可知，該回歸模型達到極顯著水平（p＜ 0.01），說明該方法是可靠的；失擬項不顯著，R2= 0.9753，表明此模型的擬合程度良好，膜通量可以用該模型進行分析和預(yù)測。通過對比表3中的F值可以看出，影響膜通量的主次順序為B＞A＞C，即操作壓力＞料液溫度＞料液pH。

表3 回歸模型方差分析表

2.3.2 各因素之間的交互作用

根據(jù)回歸方程做出的兩兩因素交互作用的響應(yīng)面分析圖見圖5。壓力（B）和pH（C）交互作用對膜通量的影響顯著。

圖5 各兩因素交互作用的響應(yīng)面

2.3.3 最優(yōu)條件的確定及驗證實驗

用Design-Expert 8.0.6軟件對二次多項式回歸方程進行計算，得到膜通量的最優(yōu)制備工藝條件：料液溫度34.7 ℃，操作壓力0.28 MPa，料液pH 7.05；此時膜通量為7.50481 L/（m2·h）。按照此條件進行驗證試驗，得到的膜通量為7.65 L/（m2·h），與理論值的相對誤差為1.93%，說明該制備方法具有一定的實際可操作性。

3 結(jié)論

乳鐵蛋白作為一種新興功能性食品配料，具有很高的營養(yǎng)價值。近年來，乳鐵蛋白的提取純化工藝和應(yīng)用在不斷提高，已成功應(yīng)用于酸奶、嬰幼兒配方奶粉[13]等產(chǎn)品中。試驗以牛初乳為原料提取乳鐵蛋白，通過響應(yīng)面法進行試驗設(shè)計、分析及優(yōu)化，得到最優(yōu)提取條件：料液溫度34.7 ℃，操作壓力0.28 MPa，料液pH 7.05，此時膜通量為7.65 L/（m2·h），與模型預(yù)測的膜通量相吻合，認(rèn)為此次試驗?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計是可行的。響應(yīng)面法優(yōu)化的最優(yōu)提取工藝高于均勻和正交設(shè)計，說明響應(yīng)面法能較好地反映各試驗因素的交互作用，是一種優(yōu)于均勻與正交設(shè)計的方法[14]。綜上，利用響應(yīng)面法對超濾法提取牛初乳中乳鐵蛋白的提取工藝的優(yōu)化是科學(xué)可靠的，該試驗為從牛初乳中提取乳鐵蛋白以及對乳鐵蛋白的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。