超聲波結合溶菌酶對鮮切蘋果保鮮的工藝優化

劉俊紅，樊媛芳，張苗玉，朱玉涵，洪軍，王錕宇

1. 河南城建學院生命科學與工程學院（平頂山 467044）；2. 中國礦業大學電力與動力工程學院（徐州 221116）

蘋果富含礦物質和維生素，是公認的營養程度較高的健康水果之一，因而受到廣大消費者的喜愛。蘋果在加工過程中，果肉暴露于空氣中易氧化變質，對產品的品質有較大影響。因此，對鮮切蘋果的保鮮技術的研究至關重要。

超聲波是一種機械振動在媒質中的傳播過程，其頻率一般在20 kHz以上[1]。超聲波主要具有機械效應、熱效應和空化效應，其中空化效應具有殺菌效力。空化效應由低頻高能量的超聲波在液體中產生，能夠破壞微生物的細胞壁，使微生物細胞內容物受到強烈振蕩，從而能夠殺死微生物[2]。超聲波處理不會對果蔬產生機械損傷，因而可以有效延長蔬菜等食品的保鮮期[3]，超聲波技術更多地在物理、化工等方面得到利用，但在水果保鮮方面應用還較少。

高翔等[4]將西洋芹用超聲波處理后再用0.40%氯化鈣處理，結果表明除菌率達到80%，抑制了呼吸作用，對VC沒有明顯破壞作用，也沒有造成機械損傷，有助于西洋芹的保鮮。

溶菌酶又稱N-乙酰胞壁質聚糖水解酶或胞壁質酶，是一種專門作用于某種目的微生物細胞壁的糖苷水解酶，主要破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1, 4糖苷鍵，從而使細胞壁中的不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂，內容物溢出而使細菌溶解[5]。因為人和動物細胞沒有細胞壁，不存在肽聚糖結構，因而溶菌酶對人體細胞沒有毒性。

溶菌酶及復合涂膜保鮮劑在果蔬中的保鮮也有一定研究應用。胡曉亮等[6]以海藻酸鈉和溶菌酶為保鮮劑對馬陸葡萄進行復合涂膜保鮮，結果表明，1%海藻酸鈉和0.1%溶菌酶處理后的馬陸葡萄，感官效果最好。

邱朝坤等[7]采用不同濃度溶菌酶、殼聚糖和氯化鈣復合保鮮液對草莓進行保鮮，結果表明0.05%溶菌酶的復合保鮮液對草莓的保鮮效果最好，失重率降低，較好地保持其風味品質。

通過研究不同超聲波溫度、超聲波功率、超聲波處理時間、溶菌酶濃度、溶菌酶作用時間對鮮切蘋果VC和還原糖[8]的影響，從而找到實現蘋果VC質量分數最大、還原糖質量分數最高的最適條件，實現對蘋果的防腐保鮮作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗原料

市售同品種蘋果。

1.1.2 主要材料

50 mL燒杯；量筒；堿式滴定管；錐形瓶；比色皿；保鮮膜。

1.1.3 主要試劑

氯化鈣（分析純，天津博迪化工股份有限公司）；抗壞血酸（分析純，洛陽市化學試劑廠）；草酸（化學純，天津市恒興化學試劑制造有限公司）；2, 6-二氯酚靛酚鈉（分析純，鄭州派尼化學試劑廠）。

1.1.4 主要試驗儀器與設備

HWS28電熱恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SHB-III型循環水式多用真空泵（鞏義市英峪華科儀器廠）；九陽JYL-C012料理機（九陽股份有限公司）；冰箱（合肥美菱股份有限公司）；T6新世紀紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 研究方法

選擇新鮮的蘋果，洗凈、去皮，切成3 g蘋果片，置于50 mL燒杯中，加入溶菌酶溶液，保鮮膜封口。設置超聲波溫度、功率、時間，進行處理。反應結束后，吹干蘋果片放入4 ℃冰箱中保存，4 d后，測定VC和還原糖的質量分數。

1.2.2 VC質量分數的測定

1.2.2.1 標準液的滴定

準確吸取1 mL配制的標準抗壞血酸溶液，加9 mL 1%草酸，用2, 6-二氯酚靛酚鈉溶液進行滴定至淡紅色，并保持15 s不褪色，即達終點。由所用2, 6-二氯酚靛酚鈉的體積計算出1 mL 2, 6-二氯酚靛酚鈉相當于多少毫克抗壞血酸（取10 mL 1%草酸作空白對照，按以上方法滴定）。

1.2.2.2 樣品液的滴定

將超聲波處理后的蘋果片從冰箱中取出，粉碎后置于50 mL燒杯中，真空抽濾，定容至50 mL，從中取10 mL進行滴定（方法同1.2.2.1）；同時取10 mL 1%草酸溶液作空白對照滴定，記錄數據。計算如式（1）（2）所示。

式中：V1為滴定樣品提取液所用2, 6-二氯酚靛酚鈉溶液體積，mL；V2為滴定空白對照所用2, 6-二氯酚靛酚鈉溶液體積，mL；V3為樣品提取液總體積，mL；D為滴定時所取樣品提取液體積，mL；m為待測樣品質量，g；T為1 mL 2, 6-二氯酚靛酚鈉相當于抗壞血酸的毫克數。

1.2.3 蘋果中還原糖質量分數的測定1.2.3.1 標準曲線的制作[9]

（1）稱取適量葡萄糖粉末，在75 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥至恒重。稱取100 mg干燥好的葡萄糖，加少量蒸餾水溶解并定容至100 mL，即配制成1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

（2）按表1取葡萄糖標準溶液于試管中，加蒸餾水稀釋至2 mL，然后加入2 mL DNS試劑，充分混勻。

表1 葡萄糖標準曲線的制作

（3）將（2）中各試管放在沸水浴中煮沸5 min，然后取出冷卻至室溫。

（4）利用紫外可見光分光光度計，于波長540 nm測定各溶液的吸光度，根據數據繪制葡萄糖標準曲線。

1.2.3.2 還原糖質量分數的計算

從1.2.2.2中的樣品液中取出1 mL，稀釋至10 mL。取出1 mL稀釋液，加入1 mL蒸餾水和2 mL DNS試劑，混合均勻后沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫，在540 nm處測定吸光度，根據式（3）計算還原糖質量分數。

還原糖=x×V×n/（m×103×V*） （3）式中：x為根據標準曲線計算得到的還原糖質量，mg；n為稀釋倍數；V為樣品液總體積，mL；m為樣品質量，g；V*為檢測時取用樣品液體積，mL。

1.3 單因素試驗

1.3.1 不同超聲波溫度對蘋果VC和還原糖的影響

取3 g洗凈去皮切片的蘋果，加入20 mL 0.15%溶菌酶液，設置超聲波溫度40 ℃、時間15 min、功率160 W，反應結束后取出，吹干，放入4 ℃冰箱保存。4 d后將蘋果片從冰箱中取出，測定VC質量分數和還原糖質量分數。

依次將超聲波溫度改為25，30，35和45 ℃，重復上述試驗。

1.3.2 不同超聲波功率對蘋果VC質量分數和還原糖質量分數的影響

將超聲波功率設定為120，140，160，180和200 W，超聲波溫度40 ℃、時間15 min，重復1.3.1的操作。

1.3.3 不同超聲波處理時間對蘋果VC質量分數和還原糖質量分數的影響

將超聲波時間改為10，15，20和25 min，設置超聲波溫度40 ℃、功率160 W，重復1.3.1的操作。

1.3.4 不同溶菌酶濃度對蘋果VC質量分數和還原糖質量分數的影響

將溶菌酶濃度改為0.05%，0.10%，0.15%，0.20%和0.25%，設置超聲波溫度40 ℃、時間15 min、功率160 W，重復1.3.1的操作。

1.3.5 不同溶菌酶作用時間對蘋果VC質量分數和還原糖質量分數的影響

將溶菌酶作用時間設置為2，4，6，8和10 d，設置超聲波溫度40 ℃、時間15 min、功率160 W，重復1.3.1的操作。

1.4 正交試驗

根據5個因素的試驗結果，設計正交試驗，探索超聲波結合溶菌酶對蘋果保鮮效果的優化條件。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線為y=3.4065x-0.0927（R2= 0.9948）。其中，x表示葡萄糖質量，mg；y表示吸光度。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 超聲波溫度對鮮切蘋果保鮮效果的影響

超聲波溫度對鮮切蘋果保鮮效果的影響見圖1和圖2。

由圖1和圖2可以看出，VC質量分數和還原糖質量分數先增加后減少，溫度35 ℃時，VC質量分數和還原糖質量分數達到最大值，分別為2.05 mg/100 g和4.794%，隨后VC質量分數和還原糖質量分數隨溫度升高而下降。

圖1 超聲波溫度對鮮切蘋果保鮮VC質量分數的影響

圖2 超聲波溫度對鮮切蘋果還原糖質量分數的影響

在一定溫度范圍內，隨著超聲波作用溫度升高，超聲波作用的滅菌效應增強，同時，隨著溫度升高，溶菌酶的滅菌效果逐漸強化，兩方面的共同作用使得蘋果的保鮮效果達到最佳；隨著溫度持續升高，酶變性、失活，滅菌效果弱化，底物的消耗增加，同時溫度升高對還原糖和VC具有破壞作用，綜合作用使得兩者的質量分數下降。

2.2.2 超聲波功率對鮮切蘋果保鮮效果的影響

超聲波功率對鮮切蘋果保鮮效果的影響見圖3和圖4。

由圖3可以看出，超聲波功率120～160 W時，VC質量分數逐漸增加，超聲波功率160 W時，VC質量分數達到最高，1.46 mg/100 g，隨后VC質量分數下降。

圖3 超聲波功率對鮮切蘋果VC質量分數的影響

由圖4可以看出，還原糖質量分數隨著超聲波功率增加呈現出先升高后降低趨勢，160 W時還原糖質量分數最高。

圖4 超聲波功率對鮮切蘋果還原糖質量分數的影響

超聲波的熱效應、空化效應和機械效應使得滅菌效果隨功率的增加而增強；功率超過一定值時，熱效應和機械效應使得酶的活性逐漸被破壞，而還原糖和VC也被破壞，因此VC質量分數和還原糖質量分數在160 W后呈下降趨勢。高功率也會增加能量的損耗，對于一定質量的原料來說，過高的功率會造成“空超”現象，因此最佳超聲波功率設定為160 W。

2.2.3 超聲波處理時間對鮮切蘋果保鮮效果的影響

超聲波處理時間對鮮切蘋果保鮮效果的影響見圖5和圖6。

由圖5可以看出，隨著超聲波處理時間延長，VC質量分數呈現先增加后減少趨勢，并在10 min時VC質量分數達到最高峰。

圖5 超聲波處理時間對鮮切蘋果VC質量分數的影響

由圖6可以看出，還原糖質量分數呈現先增加后減少趨勢，處理時間10 min時，還原糖質量分數最高。

圖6 超聲波處理時間對鮮切蘋果還原糖質量分數的影響

在一定時間范圍內，超聲波和溶菌酶作用的效果隨時間延長而強化，滅菌效果顯著，還原糖質量分數和VC質量分數逐漸增加直至最大；然而，原料長時間暴露在超聲波中，熱效應和機械效應會使溶菌酶變性失活、還原糖和VC被破壞，導致10 min后VC質量分數和還原糖質量分數下降。

2.2.4 溶菌酶濃度對鮮切蘋果保鮮效果的影響

溶菌酶濃度對鮮切蘋果保鮮效果的影響見圖7和圖8。

由圖7可以看出，隨著溶菌酶濃度升高，作用效果增強，溶菌酶濃度0.15%時，VC質量分數增加最快，繼續增加溶菌酶濃度對蘋果保鮮沒有顯著影響。

圖7 溶菌酶濃度對鮮切蘋果保鮮VC質量分數的影響

由圖8可以看出，隨著溶菌酶濃度增加，還原糖質量分數先增加后趨于穩定，溶菌酶濃度小于0.15%時，還原糖質量分數增幅較大；溶菌酶濃度大于0.15%時，還原糖質量分數無顯著變化。

溶菌酶的作用主要體現在通過降解微生物細胞壁的結構實現滅菌的目的，減少營養成分的損耗，達到保鮮的目的。在反應體系中，1, 4-糖苷鍵構成的細胞壁結構是作用的底物，酶是催化劑。隨著溶菌酶濃度的增加，作用效果增強，表現為還原糖質量分數和VC質量分數增加，直至最大；而后溶菌酶濃度的增加對于限定的底物來說，不會提升反應速率，VC質量分數和還原糖質量分數趨于穩定。

2.2.5 溶菌酶作用時間對鮮切蘋果保鮮效果的影響

溶菌酶作用時間對鮮切蘋果保鮮效果的影響見圖9和圖10。

圖9 溶菌酶作用時間對鮮切蘋果VC質量分數的影響

圖10 溶菌酶作用時間對鮮切蘋果還原糖質量分數的影響

由圖9可以看出，VC質量分數和還原糖質量分數隨著時間延長呈下降趨勢，第2～第4天下降趨勢最為緩慢，隨后VC質量分數和還原糖質量分數減少幅度增加。

反應起始，溶菌酶活性較強，高效地降解細胞壁，營養物質的保存率較高，隨著保存時間的延長，低溫下溶菌酶活性逐漸減弱，同等條件下，其作用效果降低，營養基質的降解速率加快，VC質量分數和還原糖質量分數下降迅速。溶菌酶作用時間4 d較為適宜。

2.3 正交試驗

在超聲波溫度35 ℃、超聲波功率160 W、超聲波處理時間10 min、溶菌酶濃度0.15%、溶菌酶作用時間4 d條件下，利用正交軟件設計正交試驗，因素水平表和試驗安排見表1～表3。

表1 正交試驗設計的因素及水平

2.4 正交試驗結果及分析

由表2和表3數據可知，超聲波功率和溶菌酶作用時間是影響試驗結果的主要因素。因此在實際操作中對這兩個因素應嚴格要求。

表3 正交試驗設計表（還原糖）

由正交試驗的直觀分析可得，最佳處理條件是A2B3C4D1E2，即超聲波溫度30 ℃、超聲波功率160 W、超聲波處理時間20 min、溶菌酶濃度0.05%、溶菌酶作用時間4 d時，蘋果VC質量分數最高可達2.04 mg/100 g，還原糖質量分數最高為4.294%。

表2和表3中R值的分析結果顯示，以VC質量分數為指標，A2B3C2D3E2為最佳的工藝條件；以還原糖質量分數為指標，最優的工藝條件為A3B3C1D1E2。

驗證試驗結果顯示，A2B3C2D3E2時的VC質量分數（2.08 mg/100 g）和A3B3C1D1E2條件下的還原糖質量分數（4.312%）略高于A2B3C4D1E2時的結果，結果差別不顯著，實際中可選擇A2B3C4D1E2作為最優工藝。

3 結論

利用超聲波結合溶菌酶對鮮切蘋果進行保鮮的研究，主要分析了超聲波溫度、超聲波功率、超聲波處理時間、溶菌酶濃度、溶菌酶作用時間對鮮切蘋果保鮮的影響，優化工藝條件為超聲波溫度30 ℃、超聲波功率160 W、超聲波處理時間20 min、溶菌酶濃度0.05%、溶菌酶作用時間4 d，蘋果的VC和還原糖質量分數最高，分別為2.04 mg/100 g和4.294%。