壓熱-酶解法制備黑豆抗性淀粉及其理化性質

王成祥，饒歡，張美娜，李婉珍，宋平，宋家鈺

1. 同福集團股份有限公司（蕪湖 241000）；2. 安徽工程大學微生物發酵工程技術研究中心（蕪湖 241000）

抗性淀粉（Resistant Starch，RS）是指在小腸中不能被酶解的淀粉，但在人的腸胃道結腸中可以與揮發性脂肪酸起發酵反應。它最早是由英國著名生理學家Englyst于1982年在定量測定膳食纖維中發現[1]，有部分淀粉不能被淀粉酶水解，因而將其命名為抗性淀粉。抗性淀粉具有類似膳食纖維的生理功能，有較低的血糖生成指數、降低血清膽固醇、促進無機鹽吸收等基本功效，使其具有較高的開發利用價值，倍受國內外研究學者的關注[2-4]。

目前，抗性淀粉的制備方法主要有熱處理法[5]、脫支處理法[6]、微波處理法[7]、超聲處理法[8]、螺桿擠壓法[9]、晶種誘導法[10]等。單一的處理手法使得抗性淀粉的整體結晶度和得率均較低，應用效果受到一定程度的制約，開發高效的制備方法和工藝具有重要的理論和應用價值。采用壓熱-酶解法制備黑豆抗性淀粉，考察加酶量、酶解時間、壓熱時間、壓熱溫度對抗性淀粉得率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

蓋亞農場有機黑豆，抗性淀粉約占1.76%；耐高溫α-淀粉酶（＞2100 U/g）、胰酶（含胰淀粉酶25 U/mg）、糖化酶（100000 U/g）：Aladdin；普魯蘭酶（＞1000 npun/g）：SIGMA；其他試劑均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

PHSJ-4A型pH計，上海精密科學儀器有限公司；AL104型精密電子天平，梅特勒-托利多儀器；L550臺式低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；JH723可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；JB-2010數顯恒溫磁力攪拌器，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 壓熱-酶解法制備抗性淀粉

1.3.1.1 制備工藝

將黑豆用粉碎機粉碎過0.150 mm孔徑篩，置于干燥箱中干燥，準確稱取2.0000 g干燥后的黑豆粉，置于50 mL容量瓶中，加入25 mL蒸餾水，搖勻；加入過量耐高溫α-淀粉酶（3 U/g干淀粉），于95 ℃預糊化30 min；取出冷卻，用緩沖液調pH至6.0，放入高壓滅菌鍋中高溫加熱（120 ℃，30 min）；冷卻至室溫，添加普魯蘭酶在60 ℃恒溫水浴鍋中脫支；反應結束后放入高壓滅菌鍋中100 ℃滅酶10 min；冷卻后，將容量瓶中物體轉移至50 mL離心管中，按4000 r/min離心15 min，除去上清液；將沉淀放入4 ℃冰箱冷藏24 h，取出，離心去除上清液（3500 r/min，10 min）；放置室溫后，置于60 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，粉碎過0.150 mm孔徑篩，即得黑豆抗性淀粉。

1.3.1.2 單因素試驗設計

1.3.1.2.1 普魯蘭酶添加量對抗性淀粉得率的影響

準確稱取2.0000 g過0.150 mm孔徑篩的黑豆粉，按照1.3.1.1方法制備抗性淀粉，其中普魯蘭酶的添加量分別為2，4，6，8和10 npun/g干淀粉。

1.3.1.2.2 壓熱溫度對抗性淀粉得率的影響

準確稱取2.0000 g過0.150 mm篩的黑豆粉，制備抗性淀粉，其中壓熱溫度分別為80，90，100，110和120℃。

1.3.1.2.3 壓熱時間對抗性淀粉得率的影響

準確稱取2.0000 g過0.150 mm篩的黑豆粉，制備抗性淀粉，其中壓熱時間分別為20，25，30，35和40 min。

1.3.1.2.4 普魯蘭酶酶解時間對抗性淀粉得率的影響

準確稱取2.0000 g過0.150 mm篩的黑豆粉，制備抗性淀粉，其中普魯蘭酶的酶解時間分別為4，8，12，16和20 h。

1.3.1.3 抗性淀粉含量的測定

原料中抗性淀粉含量根據參考文獻[11]進行測定。

1.3.2 黑豆抗性淀粉的理化性質研究

1.3.2.1 掃描電鏡分析

樣品粉碎過0.150 mm孔徑篩后在60 ℃干燥箱中烘干至恒重，取樣將樣品用雙面導電膠固定在金屬載物臺上，真空條件下噴金，之后將載物臺置于掃描電子顯微鏡中觀察，并選擇適當的倍數拍攝具有代表性的樣品顆粒形貌。

1.3.2.2 X-射線衍射分析

起始角2=4°，終止角2=40°，步長0.02°，掃描速度4°/min，靶型選Cu，管電流為40 mA，管壓為40 kV。

1.3.2.3 差示掃描量熱儀分析

樣品粉碎過篩，加入適量的去離子水調至樣品質量分數為30%的乳液，取10 mg左右乳質樣品于樣品盤中并立即壓緊密封；在20 ℃下放置24 h平衡水分；以惰性材料三氧化二鋁為參比，淀粉與水的質量比為 1∶2，從40 ℃升溫至190 ℃，升溫速率為10 ℃/min，通氮氣速率30 mL/min。空白樣品池作參比，銦作校準品，繪制熱譜圖并進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 壓熱-酶解法制備RS工藝條件優化

2.1.1 普魯蘭酶添加量對抗性淀粉得率的影響

由圖1可知，添加一定量普魯蘭酶后黑豆的RS得率迅速提高，且隨著普魯蘭酶添加量的增加均呈逐漸上升趨勢；在普魯蘭酶添加量為4 npun/g干淀粉時，黑豆RS得率達到最高值，為7.41%，而后隨著普魯蘭酶添加量的進一步增加，黑豆RS得率下降，但黑豆RS含量也仍是比未添加普魯蘭酶時高。

圖1 普魯蘭酶添加量對RS得率的影響

2.1.2 壓熱溫度對抗性淀粉得率的影響

由圖2可知，隨著壓熱溫度的升高，黑豆RS呈先增加后降低的趨勢；當壓熱溫度達到90 ℃時，黑豆RS得率達到最大值，為10.90%，此后隨著壓熱溫度的持續升高黑豆RS得率下降。

圖2 壓熱溫度對RS得率的影響

2.1.3 壓熱時間對抗性淀粉得率的影響

由圖3可知，隨著壓熱時間的增加，黑豆RS得率呈先上升后降低的趨勢，且在壓熱時間為30 min時RS得率達到最大，最大得率為11.06%。

圖3 壓熱時間對RS得率的影響

2.1.4 普魯蘭酶酶解時間對抗性淀粉得率的影響

由圖4可知，隨著反應時間的增加，黑豆RS得率先增加后減少，且當酶解時間為8 h時，黑豆RS得率達到最大值，最大得率為11.65%。

圖4 普魯蘭酶酶解時間對RS得率的影響

2.2 黑豆抗性淀粉理化性質分析

2.2.1 SEM結果與分析

由圖5可以看出，黑豆粉顆粒形狀較圓滑，大小均勻，表面平滑，帶有微小孔隙；壓熱酶解后的黑豆粉顆粒呈不規則的多面體結構，且顆粒體積變小，表面粗糙并伴有層疊褶皺。

圖5 黑豆原料與壓熱酶解后的黑豆樣品的掃描電鏡圖

2.2.2 XRD結果與分析

由圖6可知，原黑豆抗性淀粉X-衍射圖譜與壓熱酶解后的明顯不同。原黑豆在15.02°，17°，17.98°和23.02°處出現衍射峰，屬A型晶體；壓熱酶解后的黑豆在14.5°，17°，22°和24°處出現明顯衍射峰，屬于B型與V型混合晶體。B型晶體和V型晶體具有較強的抗酶解性，表明壓熱酶解法處理后黑豆抗酶解性增大。

圖6 純化的原黑豆與壓熱酶解后的黑豆X-衍射圖譜

2.2.3 DSC結果與分析

淀粉顆粒在發生相變化和糊化時伴隨著吸熱現象，利用DSC熱分析技術在程序控溫下測定樣品的糊化溫度和相變溫度，可反映出淀粉的微晶結構及結晶程度。由圖7可以看出，壓熱酶解后的黑豆糊化峰變寬，發生相變的初始溫度T0、終止溫度Tf、糊化溫度范圍Tr、糊化焓均有不同程度的提高，表明糊化黑豆所需的初始能量增大，糊化所需溫度增高、能量增大，破壞淀粉結晶區與非結晶區雙螺旋結構所需能量增大。

圖7 原黑豆粉與壓熱酶解后黑豆粉的DSC掃描圖

3 結論

以黑豆為原料，采用壓熱酶解法制備抗性淀粉，制備黑豆抗性淀粉的最佳工藝條件為普魯蘭酶添加量4 npun/g干淀粉，壓熱溫度90 ℃，壓熱時間30 min，酶解時間8 h。掃描電鏡、X-衍射、差示掃描量熱儀分析結果表明，經壓熱酶解處理后，黑豆的表觀結構、晶體結構和熱穩定性均發生明顯改變，形貌由表面光滑變成表面粗糙并伴有層疊褶皺，晶體結構由A型轉變成B+V型，熱穩定性和抗酶解性均有不同程度提高。