多指標正交試驗法優選黃精靈芝膠囊醇沉工藝

張海弢，付娟，李曼曼，范業文，李旭

江蘇康緣藥業股份有限公司（連云港 222001）

黃精靈芝膠囊由黃精、靈芝、紅景天等中藥組成，具有緩解體力疲勞的保健功能。保健食品復方多采取傳統水提的方式，水提取工藝有較高的安全性。由于在水提過程中，多糖、脂溶性色素等會隨有效成分一起溶出[1]。在水提液中加入適量乙醇，即可沉淀除去其中的雜質[2]。復方組分具有多靶點、多途徑等特點[3]，決定工藝指標評價逐步由單一轉向多個，以體現整體性和合理性[4]。綜合評價是利用數學方法（包括數理統計方法）[5-7]對一個復雜系統進行分析處理，是一種對多個指標、多個單位同時進行分析評價的方法。為保證制劑的質量和穩定性，提高有效成分的含量，以醇沉后紅景天苷轉移率、粗多糖轉移率和浸膏得率為綜合評價指標，采用正交試驗法優選水提液的醇沉工藝。

1 儀器和試藥

1.1 儀器與設備

LC-20AT液相色譜儀（日本島津）；UV-2700紫外分光光度計（日本島津）；HWS26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；DHG-9145A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；TDL-5-A離心機（上海安亭科學儀器廠）；H1650-W離心機（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）；BSA224S-CW電子分析天平（德國賽多利斯）；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯）；Milli-Q超純水機（美國密理博公司）；KQ-250DB型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

黃精（云南白藥集團文山七花有限責任公司經營分公司）；靈芝（亳州市宏大中藥飲片科技有限公司）；紅景天（亳州市國一堂中藥飲片有限公司）；紅景天苷（99.4% 110818-201707）、D-無水葡萄糖標準品（99.5% 110833-201205）均購自中國食品藥品檢定研究院；色譜甲醇（19025121，美國天地公司）；其他試劑除特殊說明，所用試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 指標成分測定

2.1.1 紅景天苷的測定方法

紅景天苷的測定按照《保健食品檢驗與評價技術規范實施手冊》（2003年版）[8]中“保健食品中紅景天苷的測定”進行。

2.1.1.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長為215 nm；進樣量為10 μL；流動相：甲醇-0.02 mol/L乙酸鈉（9∶91）。

2.1.1.2 對照品溶液的制備

取適量紅景天苷對照品，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為0.5 mg/mL的紅景天苷溶液，即得標準液。

2.1.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取5 g上清液，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，離心，即得。

2.1.1.4 線性關系考察

將2.1.1.2項下制備的對照品標準液稀釋成質量濃度分別為10.06，25.14，52.08，201.11和502.77 μg/mL的系列對照品溶液。按照2.1.1.1項下色譜條件進行測定，以紅景天苷對照品的峰面積為縱坐標（Y1），以其質量濃度為橫坐標（X1），繪制標準曲線，得線性回歸方程：Y1=12790904X1+1639（R2=1.0000），結果表明，紅景天苷在10.06～502.77 μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。色譜圖見圖1。

圖1 紅景天苷對照品（A）、供試品（B）HPLC圖

2.1.1.5 精密度試驗

取紅景天苷對照品溶液（質量濃度為25.14 μg/mL），連續進樣6次，測得紅景天苷峰面積的SRSD值為0.37%，表明該方法精密度良好。

2.1.1.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別于第0，第2，第4，第8，第12和第24小時注入液相色譜儀，測得紅景天苷的峰面積的SRSD值為0.60%，表明在24 h內供試品溶液穩定性良好。

2.1.1.7 重復性試驗

按照2.1.1.3項下方法平行制備6份供試品溶液，測定，6份供試品溶液中紅景天苷含量的SRSD值為0.34%，表明該方法重復性好。

2.1.1.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品，精密稱定6份，置10 mL容量瓶中，加入紅景天苷對照品。按照2.1.1.3項下方法制得供試品溶液，測定，平均回收率為100.11%，SRSD值為1.2%。

2.1.2 粗多糖的測定方法

粗多糖按照《保健食品功效成分檢測方法》中“粗多糖的測定方法”（苯酚-硫酸分光光度法）[9]規定的方法進行測定。

2.1.2.1 對照品溶液的制備

取適量D-無水葡萄糖，精密稱定，用純化水制成質量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

2.1.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取1 g粗多糖，加水溶解，轉移至25 mL量瓶中，并用純化水多次洗滌，洗滌液并入量瓶中，加水至刻度，搖勻，離心（5000 r/min，5 min），得上清液，備用。取2.5 mL上清液于50 mL離心管中，加入10 mL無水乙醇，混勻，于4 ℃冰箱靜置過夜，離心（4000 r/min，5 min），棄去上清液，殘渣用數毫升80%（V/V）乙醇溶液洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次，殘渣用水溶解并定容至50 mL，待用。精密量取1.0 mL于25 mL比色管中，加水補至2.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚試液，混合均勻后再加10.0 mL濃硫酸，于渦旋混合器混勻，在沸水浴中加熱2 min，取出置冰水浴中冷卻，待測。

2.1.2.3 線性考察

分別精密吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 2.1.2.1項下D-無水葡萄糖標準液于25 mL比色管中，加水補至2.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚試液，混合均勻后再加10.0 mL濃硫酸，混勻，在沸水浴中加熱2 min，取出置冰水浴中冷卻，得系列標準溶液。在485 nm波長處測定吸光度，以試劑空白為參比，以吸光度為縱坐標（Y2），D-無水葡萄糖質量濃度為橫坐標（X2），繪制標準曲線，得線性回歸方程：Y2=0.04111X2- 0.00505（R2=0.9991），結果表明，D-無水葡萄糖在0.815～8.15 μg/mL范圍內線性良好。

2.1.2.4 精密度試驗

取D-無水葡萄糖標準溶液（質量濃度為4.89 μg/mL），在485 nm處連續測定6次，吸光度SRSD值為0.05%，說明儀器精密度好。

2.1.2.5 重復性試驗

按2.1.2.2的供試品制備方法制備6份供試品，測定吸光度，計算得到SRSD為1.89%（n=6），結果表明此法重復性良好。

2.1.2.6 穩定性試驗

取重復性項下的供試品溶液，分別于第0，第0.5，第1，第2和第3小時測定供試品的吸光度，供試品溶液吸光度的SRSD值為0.27%，說明供試品溶液在3 h內有較好的穩定性。

2.1.2.7 加樣回收率試驗

取6份粗多糖供試品，按1∶1加入標準品，按照2.1.2.2項下方法制得供試品溶液，測定，平均回收率為100.15%，SRSD值為1.04%。

2.1.3 浸膏得率測定

精密量取V1（mL）待測樣品，置于已恒重蒸發皿中（M1），先在105 ℃水浴上揮干，再于105 ℃烘箱內干燥至恒重，取出置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱重（M2），按式（1）計算浸膏得率。

式中：m為待測樣品中藥材總質量，g；V1為精密量取的待測樣品體積，mL；V2為待測樣品總體積，mL；M1為已恒重蒸發皿的質量，g；M2為烘干恒重后蒸發皿與干浸膏的總質量，g。

2.2 基于信息熵理論的工藝評價

信息熵理論用于多指標綜合評價時，相當于將每個評價指標作為1個隨機變量，通過計算各指標的信息熵，從而給出各個指標的不同權重。對于一項評價指標，其取值變異程度越大指標越有序，信息熵就越小，其提供的信息量越多，該指標就越重要，所占權重系數就越大[10]。信息熵理論在多屬性決策問題中的應用屬于客觀賦權法的一種，通過對試驗數據的整理、計算和分析，其得到的權重系數可靠性更高。而權重系數在綜合評分中的分配直接關系工藝提取的科學性和合理性。

2.2.1 醇沉正交工藝試驗

根據中藥材性質及預試驗結果，擬定藥液濃縮相對密度、醇沉時間、醇沉濃度作為主要考察因素，采用L9(34)正交表安排試驗，以醇沉后浸膏得率、粗多糖轉移率、紅景天苷轉移率為綜合評價指標。試驗設計及結果見表1。

表1 因素水平表

2.2.2 醇沉工藝研究數據的處理

根據文獻所給出的步驟[11-12]，建立原始評價指標矩陣，原始評價矩陣如式（2）所示。

將原始數據陣（X）轉為“指標概率”矩陣（P），如式（3）所示。

計算信息熵值，確定第i項評價指標的信息熵Hi，如式（4）所示。結果顯示Hi=[0.99780.99920.9936]。

按式（5）計算各指標的權重系數Wi，Wi=[0.23020.08660.6832]。

2.2.3 正交試驗數據分析

對概率矩陣的數據進行加權處理，得綜合評價指標M，Mm=P1m×W1+P2m×W2+P3m×W3+…Pnm×Wn，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗設計及測定結果

表3 方差分析

由表2極差分析結果可知，各因素對綜合指標的影響主次順序為C＞B＞A，即醇沉濃度＞醇沉時間＞相對密度。以極差最小的D因素為誤差項進行方差分析，結果表明，C因素具有顯著性差異，A、B兩個因素無顯著性差異。最終確定最佳醇沉工藝A2B2C2，即藥液濃縮為相對密度1.10 g/mL，醇沉濃度為40%，醇沉時間為12 h。

2.3 驗證試驗

為驗證上述結論的準確性，按照最佳工藝條件A2B2C2進行3次試驗驗證，并計算浸膏得率、粗多糖轉移率、紅景天苷轉移率，結果見表4。M的平均值是0.12081，SRSD為0.41%。結果表明，優化后的醇沉工藝穩定可行，符合生產實際和工業化生產。

表4 驗證試驗結果

3 討論

黃精靈芝膠囊是中藥復方制劑，具有緩解體力疲勞的保健功能，主要有效成分紅景天苷、粗多糖是重要評價指標，干浸膏得率也是工藝生產中權衡的重要指標。醇沉是中藥提取過程中常用的工藝步驟。中藥水提液經濃縮后在常溫或低溫下加入乙醇進行醇沉，乙醇既作為溶劑，溶解濃縮液中的有效成分，又作為沉淀劑來沉淀水煎液中淀粉、樹膠、果膠、黏液質、蛋白質、蹂質、色素、無機鹽等水溶性雜質。

試驗以藥效成分紅景天苷的轉移率、粗多糖的轉移率、干浸膏得率作為綜合評分指標，在單因素基礎上采用L9(34)正交試驗，基于信息熵理論對各指標賦權重分析，優選黃精靈芝膠囊的醇沉工藝。確定了藥液相對密度1.10 g/mL，醇沉時間12 h，醇沉濃度40%的最佳醇沉工藝參數，并進行工藝驗證試驗，結果顯示該工藝合理、穩定、可行，為黃精靈芝膠囊的產業化研究提供試驗數據支撐。