不同巴氏殺菌強度對牛乳中活性蛋白的影響

劉藝婷，周凌華，許秋莉，龍芷姣，楊榮杰

深圳市晨光乳業(yè)有限公司（深圳 518000）

牛乳通過熱處理來殺死致病微生物，并盡可能延長貨架期[1-2]。按照不同熱處理強度可分為消毒乳和滅菌乳。巴氏殺菌是一種相對溫和的熱處理形式，能極大程度地保留牛乳中的營養(yǎng)成分。巴氏殺菌乳可分為低溫長時間殺菌牛乳（LTLT）和高溫短時殺菌牛乳（HTST）。牛乳經(jīng)72～85 ℃保持15 s加熱殺菌在乳品廠中廣泛使用。β-乳球蛋白（β-Lg）、Ig、Lf是牛乳中具有重要生物功能的乳清蛋白，隨熱處理強度增加，含量減少。不同的乳清蛋白在不同熱處理工藝條件下呈現(xiàn)不同的熱敏感性和變性速率。β-Lg是牛乳中的主要乳清蛋白，約占乳清蛋白的50%。免疫球蛋白是抗體，包括IgM、IgA、IgG、IgE、IgD，其中含量最高的是IgG。在乳清蛋白中，IgG對熱比較敏感，熱穩(wěn)定性最差，比其他乳清蛋白更易變性失活[3]。IgG的熱變性反應(yīng)較復(fù)雜，特別是不同的熱處理條件對蛋白質(zhì)變性過程中肽鏈的展開及蛋白質(zhì)的凝聚反應(yīng)的強度不同[4]。Lf是乳清蛋白中的一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，因其獨特而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出多種生物學(xué)功能，具有促鐵吸收、免疫調(diào)節(jié)、廣譜抗菌、抗病毒、抗氧化等作用。糠氨酸是牛乳中重要的熱敏指標(biāo)，隨熱處理強度增加，含量升高[5-7]。因此，研究不同巴氏殺菌強度對牛奶中這些活性蛋白濃度變化的影響，對保留牛乳中更多的活性物質(zhì)、評價牛奶質(zhì)量起到重要作用[8]。目前針對不同熱處理條件下牛乳中β-Lg、IgG、Lf的變化規(guī)律及相互關(guān)系開展的研究較少。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生乳1（龍門晨光乳業(yè)奶源基地有限公司）；生乳2（新陂頭奶牛場）；生乳3（甘肅前進牧業(yè)科技有限責(zé)任公司）；生乳4（博羅縣泉蒙畜牧場）。

甲醇和三氟乙酸（色譜純，美國Thermo Fisher）；糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（分析純，廣州普邁生物科技有限公司）；β-Lg、Lf、IgG蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma）；IgG和Lf檢測試劑盒（美國Bethyl Laboratories）；考馬斯亮藍染色液（碧云天生物技術(shù)公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Tetra Therm Lacta巴氏殺菌機（瑞士Tetra Pak公司）；PAS8均質(zhì)機（瑞士Tetra Pak公司）；Epoch2酶標(biāo)儀（美國Biotek instruments公司）；LC-20AT/SPD-20A高效液相色譜（含SPD-20A紫外檢測器，日本Shimadzu公司）；FOSS 8400型全自動凱氏定氮儀（丹麥FOSS公司）；AR4202CN電子天平（美國Ohaus公司）；BS124S分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；凝膠電泳儀（美國BIO-RAD公司）；其他輔助儀器設(shè)備。

1.3 方法

1.3.1 牛乳的熱處理

原料奶驗收→過濾和凈乳→冷卻→貯存→均質(zhì)→熱處理（分別包括75 ℃、15 s，78 ℃、15 s和85 ℃、15 s，3種熱處理工藝）→冷卻→灌裝

1.3.2 糠氨酸的測定

不同熱加工牛奶中糠氨酸含量測定方法參考NY/T 939—2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》[9]中糠氨酸定量部分進行檢測。

1.3.3 牛乳中β-Lg的測定

參照NY/T 1663—2008《乳與乳制品中β-乳球蛋白的測定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法》[10]進行檢測。

1.3.4 牛乳中Ig和Lf的測定

牛乳中Ig和Lf分別采用牛IgG和Lf檢測試劑盒，通過夾心ELISA方法進行檢測。每個熱處理條件下選擇3個樣品進行檢測，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下進行測定吸光度，吸光度與樣品中IgG和Lf濃度呈正比。

1.3.5 保質(zhì)期末牛乳中活性蛋白的檢測

將熱處理后的試驗樣品放置冰箱冷藏條件（2～6 ℃）下儲存7 d后測定乳中β-Lg、IgG、Lf濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同奶源中活性蛋白的濃度

抽取4個牧場（龍門、新陂頭、甘肅、泉蒙）的原料乳進行活性蛋白檢測，結(jié)果如表1所示。4個牧場生乳中Lf質(zhì)量濃度在102～118 mg/L之間，β-Lg質(zhì)量濃度在3310～3580 mg/L之間，IgG質(zhì)量濃度在347～514 mg/L之間，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥3.2 g/100 g。根據(jù)國內(nèi)外研究報道生鮮牛乳中Lf質(zhì)量濃度一般在20～200 mg/L之間，β-Lg質(zhì)量濃度在3200～5000 mg/L之間[10-14]；牛乳中IgG質(zhì)量濃度在30～614 mg/L之間，平均值在322 mg/L[15-16]。因不同生乳樣品之間的差異并不明顯，且符合相關(guān)研究報道的活性蛋白范圍。后續(xù)選擇生乳1進行不同強度的巴氏殺菌熱處理試驗。

表1 不同奶源中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及Lf、β-Lg、IgG的質(zhì)量濃度

2.2 不同巴氏殺菌強度對牛乳中糠氨酸的影響

王加啟等[17]得生乳中糠氨酸平均值為5.23 mg/100 g，生乳中糠氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)低于7 mg/100 g。從表2可以看出，中試加工所用生鮮牛乳中的糠氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.4 mg/100 g，在生乳糠氨酸濃度的正常范圍內(nèi)[7-8]。生鮮牛乳經(jīng)過75 ℃、15 s熱處理過后糠氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至6.4 mg/100 g，而殺菌溫度提高至85 ℃時，糠氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加至8.4 mg/100 g，符合研究報道巴氏殺菌乳中糠氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)小于12 mg/100 g的要求[8]。糠氨酸作為牛乳熱加工過程中蛋白質(zhì)與乳糖形成的特征產(chǎn)物，溫度越高，美拉德反應(yīng)越強烈，牛乳中形成的糠氨酸濃度也越高。

表2 不同熱處理條件下牛乳中糠氨酸、β-Lg、IgG、Lf的濃度變化

2.3 不同巴氏殺菌強度對牛乳中Lf質(zhì)量濃度的影響

從表2可以看出，生乳中Lf質(zhì)量濃度為102 mg/L。生鮮牛乳經(jīng)過75 ℃、15 s的巴氏殺菌工藝后Lf質(zhì)量濃度為73 mg/L，僅為原生鮮牛乳中的71.6%。經(jīng)過85 ℃、15 s后，Lf質(zhì)量濃度僅為37 mg/L，其降解率達63.7%。在同樣15 s加熱時間下，Lf的質(zhì)量濃度隨著溫度升高呈下降趨勢。

2.4 不同巴氏殺菌強度對牛乳中β-Lg質(zhì)量濃度的影響

從表2可以看出，生鮮牛乳中的β-Lg質(zhì)量濃度為3580 mg/L。經(jīng)過75 ℃、15 s熱處理后β-Lg質(zhì)量濃度還剩下3340 mg/L，降解率僅6.7%。78 ℃、15 s時，β-Lg的降解率為24.3%。Sakkas等[12]研究報道的生乳經(jīng)80 ℃、4 s熱處理后β-Lg的降解率為33.4%；陳美霞[8]研究發(fā)現(xiàn)生乳經(jīng)80 ℃、15 s殺菌后β-Lg的降解率為19.9%。巴氏殺菌溫度升高至85 ℃時，β-Lg質(zhì)量濃度降低至2250 mg/L，降解率為37.1%。隨著溫度升高，β-Lg的降解率升高。β-Lg濃度接近乳清蛋白總量的一半，β-Lg的變化對乳制品有很大的影響。β-Lg在30 ℃以下的牛乳中是以二聚體的形態(tài)存在的，在30 ℃以上則解離成單體。β-Lg在85 ℃以上加熱時，—S—S—鍵裂解，產(chǎn)生游離巰基，甚至產(chǎn)生揮發(fā)性的硫化物和硫化氫[3]。研究報道巴氏殺菌會改變牛乳β-LG天然結(jié)構(gòu)[18]，同時熱處理會影響β-Lg的生理功能，熱變性導(dǎo)致β-Lg的轉(zhuǎn)運功能顯著降低，并且造成過敏性反應(yīng)[19]。

2.5 不同巴氏殺菌強度對牛乳中IgG質(zhì)量濃度的影響

表2顯示，生鮮牛乳中IgG質(zhì)量濃度為347 mg/L，經(jīng)過75、15 s熱處理后IgG質(zhì)量濃度為243 mg/L，其降解率為30.0%。程金波等[20]研究發(fā)現(xiàn)牛乳在實驗室Armfield加工設(shè)備75 ℃、15 s條件下，乳中IgG變性率最小，約9.3%。在相同的15 s保持時間下，隨著溫度升高，乳中IgG濃度逐漸減少。在85 ℃、15 s殺菌工藝下，牛乳中IgG質(zhì)量濃度只剩下77 mg/L，其得率僅22.2%。研究表明牛乳在60 ℃下熱處理120 min后，牛乳的IgG濃度基本不變[21]。Mainer等[22]研究發(fā)現(xiàn)低溫長時間巴氏殺菌（LTLT，63 ℃、30 min）幾乎不影響IgG的活性。加熱30 min時，IgG的變性溫度為70 ℃，其熱穩(wěn)定性是乳清蛋白中最低[3]。

2.6 在不同巴氏殺菌強度下糠氨酸與β-Lg的關(guān)系

糠氨酸與β-Lg呈現(xiàn)一定規(guī)律，即隨著糠氨酸含量逐漸升高，β-Lg濃度逐漸減少。整體趨勢符合文獻報道[9,23]。利用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行分析，并選擇多項式進行數(shù)據(jù)擬合。結(jié)果表明，β-Lg與糠氨酸有很強的相關(guān)性，擬合曲線的R2=0.9666，擬合曲線為y= -25.625x2-113.11x+4978.1。

圖1 不同巴氏殺菌條件下牛乳中β-Lg和糠氨酸的相關(guān)性

2.7 保質(zhì)期末活性蛋白的變化

將試驗樣品放在2～6 ℃冷藏條件下儲存至7 d后檢測β-Lg、IgG、Lf的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，縱坐標(biāo)以生乳1中活性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，β-Lg、IgG、Lf質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本不變或略有降低。說明在冷藏條件下，貨架期內(nèi)牛乳中的活性蛋白的狀態(tài)比較穩(wěn)定，基本不發(fā)生降解。

圖2 保質(zhì)期內(nèi)牛乳中不同活性蛋白的變化

3 結(jié)論

試驗表明經(jīng)75 ℃、15 s熱處理后，牛乳中的活性蛋白都有較大程度保留。但是經(jīng)85 ℃、15 s熱處理后，牛乳中的Ig、Lf損失比較大，降解程度達到63.7%～78.5%，提示巴氏殺菌強度控制在72～75 ℃、15 s時，不但可以保證產(chǎn)品質(zhì)量安全，而且能較多地保留牛乳中的營養(yǎng)活性物質(zhì)。同時保證產(chǎn)品的冷藏條件（2～6 ℃）有利于保持其貨架期內(nèi)活性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。