紫外發(fā)光二極管對P. deceptionensis CM2殺菌作用及機(jī)制

劉驍，李云菲，王雯雯，相啟森, ，趙衛(wèi)東，杜桂紅

1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（鄭州 450001）；2. 河南開封大用實(shí)業(yè)有限公司（開封 475200）

隨著生活水平的提高，消費(fèi)者食品安全意識的增強(qiáng)，食源性致病菌引發(fā)的食品安全問題受到廣泛關(guān)注[1]。滅菌是最有效的食品保鮮工藝之一，被廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。熱處理是最常用的滅菌方法，但是熱加工會引起食品的不良化學(xué)或物理變化，導(dǎo)致食品的感官品質(zhì)下降及營養(yǎng)物質(zhì)破壞[2]。因此，紫外線、脈沖光、高壓二氧化碳、冷等離子體等非熱加工技術(shù)成為食品加工領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3-6]。

紫外線（UV）是一種波長位于可見光和X射線之間的電磁波，按波長不同可分為UVA（320～400 nm）、UVB（280～320 nm）和UVC（200～280 nm），其中UVC殺菌效果最強(qiáng)。目前廣泛應(yīng)用的紫外光源大多是汞燈，存在能耗大、易損壞、使用成本高、汞污染等問題[7-8]。近年來，紫外發(fā)光二極管（UVC-LEDs）的應(yīng)用受到關(guān)注，廣泛應(yīng)用于水污染治理、食品殺菌、醫(yī)療消毒等領(lǐng)域[9-11]。與傳統(tǒng)的紫外線汞燈相比，UVC-LEDs具有壽命長、電壓低、能耗低、波長可調(diào)、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。試驗(yàn)研究UVC-LEDs對分離自腐敗雞肉的假單胞菌CM2（P.deceptionensisCM2）的滅活作用及機(jī)理，以期為紫外線殺菌技術(shù)在食品保鮮中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷鮮雞胸肉（購自鄭州某大型超市，4 ℃儲藏備用）；P.deceptionensisCM2菌株（實(shí)驗(yàn)室分離自腐敗雞肉，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為Pseudomonas deceptionensis）。

營養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar，NA）、營養(yǎng)肉湯（Nutrient broth，NB）（青島海博生物有限公司）；碘化丙啶（PI）、戊二醛（上海阿拉丁生物科技股份有限公司）；乙酸戊乙酯、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙醇（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

275 nm單峰發(fā)射的UVC-LEDs裝置（自制）；MJ-54A型高壓滅菌鍋（施都凱儀器設(shè)備有限公司）；SPX-250BIII型生化培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；Scientz-04型拍打式勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；JSM-700IF型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司）；Tecan Spark 20M型多功能微孔板讀數(shù)儀（瑞士Tecan公司）；NanoDrop 2000型超微量分光光度計(jì)（美國Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 P.deceptionensisCM2菌懸液制備

從-80 ℃甘油保存管中挑取一環(huán)菌液于NA培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線，30 ℃培養(yǎng)48 h，獲得單菌落連續(xù)傳代培養(yǎng)2代后，挑取單菌落于NB培養(yǎng)基中，于25 ℃、以150 r/min振蕩搖床培養(yǎng)12 h。所得菌液于8000 r/min、4 ℃離心10 min，棄去上清后用0.85%無菌生理鹽水清洗2次（離心同上），用0.85%無菌生理鹽水重懸至菌濃度為108～109CFU/mL，備用。

1.3.2 UVC-LEDs處理對P.deceptionensisCM2失活效果評價(jià)

取30 mL P.deceptionensisCM2菌懸液于培養(yǎng)皿（90 mm×20 mm）中，置于距離UVC-LEDs 10 cm，處理強(qiáng)度為20 μW/cm2處，分別處理100，200，300和400 s（對應(yīng)劑量分別為2，4，6和8 mJ/cm2）。為保證UVCLEDs處理效果均勻，菌液進(jìn)行磁力攪拌（300 r/min）。取1 mL處理后的菌液，用0.85%無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，吸取100 μL稀釋后的菌液于NA培養(yǎng)基并涂布，30 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果表示為log10CFU/mL。UVC-LEDs處理劑量按式（1）[14]計(jì)算。

式中：UVC275為UVC-LEDs處理劑量，mJ/cm2；T為UVC-LEDs處理時(shí)間，s；I為UVC-LEDs的處理強(qiáng)度，μW/cm2。

1.3.3 UVC-LEDs對雞胸肉表面P.deceptionensisCM2滅活效果

冷鮮雞胸肉經(jīng)無菌水清洗后，用無菌刀切成尺寸為3×4×0.5 cm3（7.00±0.05 g）的樣品，用75%酒精清洗樣品除去樣品表面微生物，用無菌水清洗2次去除樣品表面殘留的酒精，取出樣品將表面水分擦拭干凈。取100 μL菌懸液均勻接種于樣品表面，置于UVC-LEDs處理不同劑量（0，1000，2000，3000和4000 mJ/cm2）。取出樣品放入裝有63 mL 0.85%無菌生理鹽水的均質(zhì)袋內(nèi)，經(jīng)Scientz-04型拍打式勻漿機(jī)拍打2 min，取1 mL上述混合樣液用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋至合適梯度。取100 μL稀釋后的菌液于NA培養(yǎng)基并涂布，30 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果表示為log10CFU/g。

1.3.4 P.deceptionensisCM2細(xì)胞形態(tài)觀察

參考Wen等[15]和Xiang等[16]的方法，采用場發(fā)射掃描電鏡（FE-SEM）觀察P.deceptionensisCM2細(xì)胞形態(tài)變化。P.deceptionensisCM2菌懸液經(jīng)UVC-LEDs處理0和4000 mJ/cm2后，2.5%戊二醛4 ℃固定4 h，棄去固定液，用0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌樣品3次，用30%，50%，70%，90%和100%（V/V）乙醇溶液對樣品依次逐級脫水各10 min，乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次10 min（以上每步操作完成后，以6000 r/min離心10 min），最后一次留微量液體，混勻滴到載玻片上，45 ℃烘干過夜，采用真空蒸鍍儀噴金150 s，并通過JSM-700IF型場發(fā)射掃描電鏡觀察并采集圖像。

1.3.5 胞外核酸和蛋白含量的測定

P.deceptionensisCM2菌懸液經(jīng)UVC-LEDs處理不同劑量（0，1000，2000，3000和4000 mJ/cm2）后，于12000 r/min、4 ℃離心2 min，收集上清，采用NanoDrop 2000型超微量分光光度計(jì)測定上清液中的核酸和蛋白含量。

1.3.6 PI熒光染色

參考Kim等[17]的試驗(yàn)方法，采用PI評價(jià)細(xì)胞膜的通透性。P.deceptionensisCM2菌懸液經(jīng)UVC-LEDs處理不同劑量（0，1000，2000，3000和4000 mJ/cm2）后，加入終濃度為3.0 μmol/L的PI染液并置于室溫暗處孵育10 min，于8000 r/min離心10 min，棄去上清，0.85%生理鹽水洗滌2次，采用Tecan Spark 20M型多功能微孔板讀數(shù)儀測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為520 nm，發(fā)射波長為601 nm。PI相對熒光強(qiáng)度按式（2）計(jì)算。

式中：F1為處理組細(xì)胞熒光強(qiáng)度；F0為未處理組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

所有試驗(yàn)均做3次平行，試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Prism軟件（Graphpad 8.0）繪圖，IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（ANOVA）中的最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 UVC-LEDs對P. deceptionensis CM2的失活效果

UVC-LEDs對純培養(yǎng)體系中P.deceptionensisCM2的滅活效果見圖1。P.deceptionensisCM2的菌落數(shù)隨著紫外劑量的升高而顯著降低（p＜0.05），呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與對照組相比（初始菌落數(shù)8.26 log10CFU/mL），處理劑量為2，4，6和8 mJ/cm2時(shí)，P.deceptionensisCM2活菌數(shù)分別降低1.04，2.04，5.22和6.09 log10CFU/mL。

圖1 UVC-LEDs對P. deceptionensis CM2的失活作用

2.2 UVC-LEDs對雞肉表面P. deceptionensis CM2的失活效果

由圖2可知，雞胸肉表面P.deceptionensisCM2的菌落數(shù)隨UVC-LEDs處理劑量升高而降低，這與UVCLEDs對P.deceptionensisCM2菌液的滅活結(jié)果相一致。輻照劑量4000 mJ/cm2時(shí)，雞胸肉表面P.deceptionensisCM2的菌落數(shù)由初始的7.84 log10CFU/g降低至5.39 log10CFU/g，降低2.45 log10CFU/g。

由圖1和圖2可知，UVC-LEDs對純培養(yǎng)體系中細(xì)菌的滅活效率顯著高于對雞胸肉表面細(xì)菌的滅活效率。研究證明，待處理樣品的成分、厚度和表面特性等均能夠顯著影響UVC-LEDs的殺菌效果[18-19]。為進(jìn)一步增強(qiáng)其殺菌效果，一般將紫外線與其他技術(shù)相結(jié)合。如，Degala等[20]發(fā)現(xiàn)1%檸檬草精油和UVC（24 mJ/cm2）協(xié)同處理可使羊肉表面的E.coliK12數(shù)量降低6.66 log10CFU/mL，顯著優(yōu)于相同劑量的UVC單獨(dú)處理組（降低1.06 log10CFU/mL）。

圖2 UVC-LEDs處理對雞胸肉表面P. deceptionensis CM2的失活作用

2.3 UVC-LEDs對P. deceptionensis CM2細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖3可知，未經(jīng)處理組P.deceptionensisCM2細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，呈短棒狀；而處理劑量4000 mJ/cm2時(shí)，P.deceptionensisCM2細(xì)胞形態(tài)與未處理組相比發(fā)生明顯變化，細(xì)胞皺縮，表面粗糙并出現(xiàn)褶皺，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露，進(jìn)而影響微生物的正常代謝。Wan等[21]也觀察到經(jīng)UV-LEDs（280 nm，140 mJ/cm2）處理后，哈茨木霉（Trichoderma. harzianum）、波蘭青霉（Penicillium. polonicum）和黑曲霉（Aspergillus niger）孢子形態(tài)發(fā)生不同程度的皺縮，其中波蘭青霉孢子皺縮最為嚴(yán)重。

圖3 UVC-LEDs處理對P. deceptionensis CM2細(xì)胞形態(tài)的影響（×16000）

2.4 UVC-LEDs對P. deceptionensis CM2膜通透性的影響

通過測定胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)釋放量評價(jià)UVC-LEDs對P.deceptionensisCM2細(xì)胞膜通透性的影響。由圖4可知，隨著UVC-LEDs處理劑量（0～4000 mJ/cm2）的升高，P.deceptionensisCM2上清液中核酸含量顯著增加（p＜0.05），且呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)處理劑量為4000 mJ/cm2時(shí)，胞外核酸含量由對照組的1.67 μg/mL顯著增加至10.59 μg/mL（p＜0.05）。

圖4 UVC-LEDs處理對P. deceptionensis CM2胞外核酸含量的影響

由圖5可知，與對照組相比，處理劑量4000 mJ/cm2時(shí)，胞外蛋白含量升高181%（p＜0.05），其胞外蛋白含量隨著輻照劑量升高而顯著增多（p＜0.05），這與UVC-LEDs對P.deceptionensisCM2胞外核酸含量的影響結(jié)果相一致。結(jié)果表明，UVC-LEDs處理導(dǎo)致P.deceptionensisCM2細(xì)胞膜通透性增加，造成胞內(nèi)核酸、蛋白等組分釋放到胞外，影響細(xì)胞正常生理代謝，從而造成微生物死亡。

圖5 UVC-LEDs處理對P. deceptionensis CM2胞外蛋白含量的影響

2.5 UVC-LEDs對P. deceptionensis CM2細(xì)胞膜完整性的影響

研究表明，當(dāng)細(xì)胞膜發(fā)生破損時(shí)，PI透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生紅色熒光[22]。因此，可以用細(xì)胞內(nèi)PI攝入量評價(jià)細(xì)胞膜的完整性。由圖6可知，與對照組相比，經(jīng)UVC-LEDs處理（1000～ 4000 mJ/cm2）后，P.deceptionensisCM2細(xì)胞中PI熒光強(qiáng)度顯著增加（p＜0.05）。與對照組相比，處理劑量4000 mJ/cm2時(shí)，P.deceptionensisCM2細(xì)胞中PI相對熒光強(qiáng)度升高563.59%（p＜0.05）。結(jié)果表明，UVCLEDs處理破壞了P.deceptionensisCM2細(xì)胞膜完整性，這可能是其失活微生物的重要機(jī)制之一。

圖6 UVC-LEDs處理對P. deceptionensis CM2細(xì)胞膜完整性的影響

3 結(jié)論與討論

結(jié)果表明，UVC-LEDs對分離自腐敗雞肉的P.deceptionensisCM2具有良好的失活效果，且失活效果隨處理劑量的升高而增強(qiáng)，呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。處理劑量為8 mJ/cm2和4000 mJ/cm2，純培養(yǎng)體系和雞肉表面P.deceptionensisCM2分別降低6.09 log10CFU/mL和2.45 log10CFU/g。FE-SEM結(jié)果表明，UVCLEDs（4000 mJ/cm2）處理后P.deceptionensisCM2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯皺縮。隨著處理劑量（1000～4000 mJ/cm2）的升高，P.deceptionensisCM2細(xì)胞PI熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，胞外核酸蛋白含量顯著增加。試驗(yàn)表明UVC-LEDs殺菌作用可能與其破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和增加細(xì)胞膜通透性有關(guān)。在今后研究中可將UVC-LEDs技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合提高殺菌效果，并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)對其殺菌機(jī)理進(jìn)行深入研究。