類球紅細菌粗提物對風干期臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化的影響

趙志平，康馨樾，張鈺麟，王衛(wèi)，吉莉莉，張佳敏

成都大學肉類加工四川省重點實驗室（成都 610106）

臘腸是中國傳統(tǒng)肉制品，色澤誘人，具有獨特的風味和口感，深受人們喜愛。脂肪和蛋白質(zhì)是臘腸的重要組成部分，脂肪和蛋白質(zhì)的適度氧化是臘腸風味物質(zhì)產(chǎn)生的主要來源，對臘腸的品質(zhì)起決定性作用。脂肪適度氧化后產(chǎn)生小分子的揮發(fā)性物質(zhì)是醛類、烴類、醇類、酸類及酮類等揮發(fā)性風味物質(zhì)的重要來源，對改善臘腸等肉制品的風味具有極其重要的作用[1-2]。蛋白質(zhì)的適度降解可以產(chǎn)生小肽及氨基酸等物質(zhì)，在提升臘腸等肉制品的風味和營養(yǎng)價值方面發(fā)揮重要作用[3]。然而，臘腸脂肪、蛋白質(zhì)過度氧化，尤其是脂肪過度氧化會造成酸敗，導(dǎo)致臘腸品質(zhì)大幅降低，消費者不再認可[4]。加工臘腸時添加亞硝酸鹽不僅可以有效抑制脂肪和蛋白質(zhì)氧化分解，也可以改善臘腸的風味[5]。但亞硝酸鹽毒性較強，可與生物胺反應(yīng)生成具有強致癌作用的亞硝胺，影響臘腸的食用安全性。

除硝酸鹽和亞硝酸鹽外，使用微生物發(fā)酵劑或天然植物提取物也能有效抑制肉制品脂肪和蛋白質(zhì)氧化。張學穎等[6]使用植物乳桿菌X3-9和干酪乳桿菌X3-12作為發(fā)酵劑生產(chǎn)羊肉香腸，研究發(fā)現(xiàn)添加發(fā)酵劑的羊肉香腸的TBARs值比對照組更低。曹辰辰等[7]使用植物乳桿菌和模仿葡萄球菌作為混合發(fā)酵劑制作發(fā)酵香腸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)功能發(fā)酵劑能夠顯著降低香腸的TBARs值和巰基值，提高羰基值，表明脂肪和蛋白質(zhì)氧化得到顯著抑制。植物提取物如茶多酚、桂皮提取物等能顯著抑制肉制品脂肪氧化[8-9]。香腸中添加0.6%桂皮提取物效果與0.02%二丁基羥基甲苯相當，能夠有效抑制中式香腸TBA值和羰基值的升高，并且改善香腸的品質(zhì)[8]。研究表明，辣椒籽提取物能夠顯著抑制冷卻肉TBARs值和POV值的升高，并且延長冷卻肉的貨架期[10]。

類球紅細菌分布廣泛，生命力強，易于培養(yǎng)，富含類胡蘿卜素、輔酶Q10、超氧化物岐化酶、維他命等天然活性物質(zhì)，在食品、醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[11-12]。類球紅細菌基因組含有一套完整的合成類胡蘿卜素和輔酶Q10的代謝途徑，在合適的生長代謝條件下能夠大量合成天然類胡蘿卜素和輔酶Q10[13-14]。類球紅細菌自身還編碼多種與抗氧化相關(guān)的蛋白質(zhì)，趙志平等[15]研究發(fā)現(xiàn)類球紅細菌OmpR家族蛋白OmpR-1在其抗氧化脅迫過程中發(fā)揮重要作用。此外，類球紅細菌作為益生菌有著廣泛的應(yīng)用前景，被廣泛用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖[16-17]。基于類球紅細菌富含類胡蘿卜素和輔酶Q10等天然抗氧化活性物質(zhì)，試驗將類球紅細菌粗提物作為臘腸加工的輔料抑制臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化，為利用類球紅細菌代謝物改善肉制品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

類球紅細菌Rhodobactersphaeroides（實驗室保存）；豬肉（四川高金實業(yè)集團股份有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

YP302N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；PHS-3C-01型pH計（上海三信儀表廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6（常州澳華儀器有限公司）；HC-2518臺式高速離心機（湘儀設(shè)備有限公司）；UV-1801紫外可見分光光度計（北京北分瑞利有限公司）；EPED-E2-10TJ超純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；756PC型生化培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；DHP-9160B通用型超凈工作臺（上海舜宇平科學儀器有限公司）；立式自動壓力蒸汽滅菌器GR60DA（致微（廈門）儀器有限公司）；立式雙層全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器SPH-2102C（上海程造儀器設(shè)備有限公司）；超聲波細胞粉碎機Scientz-650E（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 類球紅細菌的培養(yǎng)

將-80 ℃保存的類球紅細菌劃線培養(yǎng)于R?固體培養(yǎng)基上[18]，在30 ℃培養(yǎng)3 d長出紅色單菌落，挑取紅色單菌落接種到R?液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至A660nm= 0.4～0.8。將活化的類球紅細菌按2%接種到錐形瓶中，30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.2 類球紅細菌粗提物的制備

將培養(yǎng)的類球紅細菌在離心力7000g，4 ℃條件下離心10 min。按1 L菌用10 mL生理鹽水的比例重懸后超聲波破碎。超聲波破碎條件為：功率200 W，總時間20 min，工作6 s，停歇7 s。超聲后，在離心力8000g，4 ℃條件下離心10 min收集上清即為類球紅細菌粗提物。

1.3.3 臘腸制作工藝

原料肉處理→肥肉瘦肉均切細絲→混料（前夾肉，W瘦肉∶W肥肉=7∶3、味精1.5%（W/W）、食鹽2%（W/W）、十三香3%（W/W））→每1 kg肉加入1 L類球紅細菌的粗提物混勻→灌腸→成熟風干（白天12 ℃，晚上8 ℃，相對濕度70%～80%）。以生理鹽水代替類球紅細菌粗提物制作的臘腸作為對照，對照和樣品均不適用亞硝酸鹽。

1.3.4 TBA測定

TBA測定采用GB 5009.181—2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》中的分光光度法。

1.3.5 羰基值測定

稱取5 g去掉肥肉并絞碎的豬肉樣品，在20 mL預(yù)冷的提取液（10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，含100 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EDTA，pH 7.0）中勻漿60 s。吸取1 mL勻漿液到10 mL EP管中，每管加入1 mL 10 mmol/L的DNPH溶液（2 mol/L HCl為溶劑）在室溫下避光反應(yīng)1 h。將另外1 mL勻漿液與1 mL 2 mol/L HCl（對照）混合。孵育后，加入1 mL 20% TCA，并將混合物以10000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清液。用1 mL乙酸乙酯-乙醇（1∶1，V/V）洗滌沉淀3次，加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，37 ℃孵育15 min后10000 r/min，4 ℃離心5 min，在370 nm波長處測定上清液的吸光度。根據(jù)式（1）計算羰基值，表示為nmol羰基/mg蛋白。

式中：A370nm為370 nm下的吸光度；2.2×104L/（mol·cm）為摩爾吸光系數(shù)；106為單位換算系數(shù)；C為用考馬斯亮藍法在595 nm下測得的勻漿液蛋白濃度。

1.3.6 總巰基值的測定

依據(jù)DTNB法，吸取1 mL羰基測定中的勻漿液，與8 mL Tris-甘氨酸溶液（每升該溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g EDTA、8 mol尿素，pH 8）混合均勻，均質(zhì)60 s，然后按10000 r/min，4 ℃離心15 min。吸取上清液4.5 mL與0.5 mL 10 mmol/L 5, 5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）混合（DTNB）。在40 ℃水浴中孵育30 min。在412 nm處測定上清液的吸光度。根據(jù)式（2）計算總巰基值，表示為nmol巰基/mg蛋白。

式中：A412nm為412 nm下的吸光度；1.36×104為摩爾吸光系數(shù)；106為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)；C為用考馬斯亮藍法在595 nm下測得的勻漿液蛋白濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 風干期臘腸TBARs值的測定

臘腸風干期間TBARs值的變化如圖1所示。隨著風干時間延長，樣品和對照的TBARs值都呈上升趨勢。風干第2天時，對照和樣品的TBARs值沒有顯著性差別，說明風干2 d時脂肪氧化沒有顯著性差異。但從第4天開始，對照和樣品的TBARs值出現(xiàn)顯著性差異，并且差異越來越大。樣品TBARs值在風干過程中上升比較緩慢，樣品0 d和2 d、2 d和4 d、4 d和6 d、8 d和10 d的TBARs值對比沒有發(fā)生顯著性變化（p＞0.05），但6 d和8 d的TBARs值有顯著性變化（p＜0.01）。而對照0 d與2 d，4 d和6 d之間的TBARs值沒有顯著性變化，2 d和4 d、6 d和8 d、8 d和10 d之間有顯著性差異（p＜0.01）。對照和樣品TBARs值在風干期的變化趨勢及變化速率表明，對照脂肪氧化的速度明顯快于樣品脂肪氧化的速度，說明類球紅細菌粗提物有效抑制臘腸的脂肪氧化。類球紅細菌粗提物中含有豐富的類胡蘿卜素、輔酶Q10等抗氧化活性物質(zhì)，在臘腸風干過程中有效發(fā)揮抗氧化作用從而抑制臘腸脂肪氧化，但類球紅細菌粗提物的添加對臘腸內(nèi)源性脂肪酶活性的影響需要進一步探究。

圖1 對照和樣品臘腸風干期間TBARs值的變化情況

2.2 風干期臘腸羰基值的測定

羰基值是反映蛋白質(zhì)氧化的重要指標之一，能反映出蛋白質(zhì)的氧化程度，羰基值越高說明蛋白質(zhì)氧化程度就越高。從圖2可以看出，隨著風干時間延長，對照和樣品臘腸的羰基值都呈現(xiàn)上升趨勢，并且從風干第2天開始，對照的羰基值和樣品的羰基值存在顯著性變化（p＜0.01），表明類球紅細菌粗提物在風干過程中顯著抑制臘腸蛋白質(zhì)氧化。雖然樣品羰基值也表現(xiàn)出逐步上升趨勢，但風干0 d和2 d、4 d和6 d、6 d和8 d、8 d和10 d相比，羰基值沒有發(fā)生顯著性變化（p＞0.05），只有風干2 d和4 d的相比發(fā)生顯著性變化（p＜0.05）。對照羰基值在風干期間的變化比較顯著，0 d和2 d、2 d和4 d相比發(fā)生顯著性變化（p＜0.01），6 d和8 d相比也發(fā)生顯著性變化（p＜ 0.05），而4 d和6 d、8 d和10 d相比沒有發(fā)生顯著性變化（p＞0.05）。試驗數(shù)據(jù)表明，類球紅細菌粗提物有效延緩臘腸蛋白質(zhì)的氧化，但類球紅細菌粗提物對臘腸內(nèi)源性蛋白酶活性的影響需要進一步探究。

圖2 對照和樣品臘腸風干期羰基值的變化

2.3 風干期臘腸總巰基值的測定

總巰基值是反映蛋白質(zhì)未被氧化的指標，總巰基值越高，說明未被氧化的蛋白質(zhì)越多，表明蛋白質(zhì)氧化的程度越低。從圖3可以看出，在臘腸風干期間，隨著風干時間延長，總巰基值越來越低，表明臘腸蛋白質(zhì)氧化程度越來越高。從風干第4天開始，對照的總巰基值顯著性低于樣品的總巰基值（p＜0.01），表明樣品臘腸的蛋白質(zhì)氧化程度顯著低于對照臘腸蛋白質(zhì)氧化程度，說明類球紅細菌粗提物有效抑制臘腸蛋白質(zhì)氧化。此外，對照總巰基值降低的速度快于樣品組。樣品總巰基值在風干過程中下降緩慢，0 d和2 d、2 d和4 d、4 d和6 d、6 d和8 d、8 d和10 d的總巰基值沒有顯著性變化（p＞0.05）。而對照0 d和2 d、8 d和10 d之間的總巰基值存在極顯著性差異（p＜ 0.01），2 d和4 d、4 d和6 d、6 d和8 d之間也存在顯著性差異（p＜0.05），說明對照的總巰基值在風干期的不同階段均顯著降低，對照蛋白質(zhì)氧化的速度明顯快于樣品蛋白質(zhì)的氧化速度。

圖3 對照組和樣品組臘腸風干期總巰基值的變化

2.4 風干期臘腸微生物總菌數(shù)、pH和水分活度的測定

肉制品脂肪和蛋白質(zhì)氧化與微生物尤其是腐敗菌有密切關(guān)系。樣品和對照臘腸的總菌計數(shù)結(jié)果如圖4～圖6所示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示，風干期對照臘腸和樣品臘腸的總菌數(shù)沒有顯著性差異（p＞0.05），這與風干期對照臘腸和樣品臘腸的水分活度沒有顯著性差異結(jié)果一致（p＞0.05），初步說明對照和樣品臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化的顯著性差異與微生物總數(shù)之間沒有必然關(guān)聯(lián)，進一步表明類球紅細菌粗提物能夠有效抑制臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化。但在風干期間，樣品的pH始終顯著高于對照的pH（p＜0.05），這可能與類球紅細菌粗提物呈弱堿性（約pH 8.0）有關(guān)，樣品臘腸pH的提高對蛋白酶和脂肪酶的活性需作進一步研究。

圖4 對照組和樣品組臘腸風干期微生物總菌數(shù)的變化

圖5 對照組和樣品組臘腸風干期水分活度的變化

圖6 對照組和樣品組臘腸風干期pH的變化

3 結(jié)論

試驗探究類球紅細菌粗提物對風干期臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化的影響。類球紅細菌粗提物富含類胡蘿卜素、輔酶Q10等天然抗氧化活性物質(zhì)，試驗結(jié)果表明類球紅細菌粗提物有效抑制臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化（p＜0.01），但對風干期臘腸的微生物總菌數(shù)、水分活度和pH沒有顯著性影響（p＞0.05）。類球紅細菌粗提物對臘腸內(nèi)源性脂肪酶和蛋白酶活性的影響及其抑制臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化的機理尚需進一步探討。類胡蘿卜素、輔酶Q10等天然活性物質(zhì)在食品、醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，試驗結(jié)果為利用類球紅細菌改善肉制品品質(zhì)提供理論依據(jù)。