羅布麻茶中總黃酮測定方法

何偉，王莉，黃景鳳，劉磊，楊如鋼，黃升

1. 阿勒泰戈寶茶股份有限公司（阿勒泰 836500）；2. 阿勒泰戈寶茶股份有限公司烏魯木齊分公司（烏魯木齊 830015）；3. 阿勒泰戈寶茶股份有限公司深圳分公司（深圳 518001）

羅布麻Apocynum venetumL.（紅麻）是夾竹桃科羅布麻屬多年生宿根草本植物，唐代《新修本草》、明代《救荒本草》稱“漆澤”，近代《中國高等植物》稱“茶葉花”。自20世紀50年代起，先后經過我國幾十個科研院所、百余名科研人員的研究與臨床實驗表明，羅布麻（紅麻）葉具有清血脂、降血壓、解郁安神、清熱消炎、利尿消腫、抗氧化等功效，尤其降血壓功能比較顯著。羅布麻葉中富含黃酮類、有機酸、醇類、氨基酸、微量元素等活性物質，大量試驗表明黃酮類物質是羅布麻葉中的主要活性成分之一[1-4]。總黃酮包括黃酮與黃酮醇類等，是具有苯駢呋喃環結構的一類天然化合物總稱。目前，檢測總黃酮的方法有多種，研究發現不同的檢測方法測出羅布麻茶中的總黃酮含量不盡相同，有時還有較大差異[5-9]。試驗采用硝酸鋁顯色對羅布麻茶中的總黃酮含量進行檢測，以期為羅布麻茶的進一步開發和研究提供參考[10-11]。

1 材料與方法

1.1 材料

羅布麻茶樣品來自于阿勒泰戈寶茶股份有限公司自生產的戈寶紅麻?羅布麻茶。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的制備

精確吸取0，0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 mL蘆丁標準溶液于10 mL比色管中，加入30%乙醇液至5 mL，各加0.3 mL 5% NaNO2溶液，振搖后放置5 min，加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻后放置6 min，加2 mL 1.0 moL/L NaOH溶液，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，同時做空白，在510 nm處測定吸光度。

1.2.2 樣品處理[12-14]

取約1 g羅布麻茶試樣粉末，準確稱定，倒入錐形瓶中，準確加入25 mL 70%乙醇，稱其質量，回流1 h，冷卻后，再次稱其質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻后過濾，取1 mL濾液于蒸發皿中，加1 g聚酰胺粉，水浴上待乙醇揮發后轉入層析柱。依次用20 mL石油醚、甲醇進行洗脫，將洗脫液濃縮，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，定容。

1.2.3 樣品測定

準確吸取2 mL供試品溶液于10 mL比色管中，加30%乙醇至5 mL，照1.2.1，自“0.3 mL加5% NaNO2溶液”起，依法測定吸光度，并根據回歸方程計算樣品中總黃酮的含量。

1.2.4 顯色劑質量分數選擇[15-17]

1.2.4.1 NaNO2質量分數

吸取2 mL 150 μg/mL蘆丁標準品溶液，分別加入0.5 mL 1%，3%，5%，7%和9% NaNO2溶液，其余同1.2.3。

1.2.4.2 Al(NO3)3質量分數

吸取2 mL 150 μg/mL蘆丁標準品溶液，分別加入0.5 mL 2.5%，5%，7.5%，10%，12.5%和15% Al(NO3)3溶液，其余同1.2.3。

1.2.4.3 NaOH 質量分數

吸取2 mL 150 μg/mL蘆丁標準品溶液，分別加入4 mL 1.5%，2.5%，4%，5.5%和7% NaOH溶液，其余同1.2.3。

2 結果與分析

2.1 顯色劑質量分數的選擇

結果表明，NaNO2質量分數在1%～5%范圍內吸光度逐漸增加，當質量分數＞5%時，吸光度有所下降，所以將NaNO2的質量分數設為5%；Al(NO3)3質量分數在2.5%～10%范圍內吸光度呈現不斷上升趨勢，隨后隨質量分數的增加，吸光度開始下降，固將質量分數設為10%；NaOH質量分數在1%～4%范圍內吸光度逐漸增加，當質量分數＞4%時，吸光度有所下降，故將質量分數設為4%。結果見圖1。

圖1 試劑質量分數的選擇

2.2 提取溶劑質量分數比較

取1 g供試品，分別加30%，50%，70%和95%乙醇回流提取1 h。紫外分光光度法中并未明確提取乙醇體積分數，通過表1可知，70%乙醇的提取效果最佳。

表1 乙醇體積分數對總黃酮質量分數的影響

2.3 提取時間比較

取1 g供試品，分別加70%乙醇回流提取0.5，1，1.5和2 h。測定結果見表2。1 h提取已較完全，在相同的時間內，回流提取比超聲提取率高。紫外分光光度法中采用超聲提取，從表2可看出，回流提取較超聲提取來說提取得更加充分。

表2 不同提取時間與總黃酮質量分數

2.4 方法學驗證

2.4.1 線形關系考察

按1.2.1要求，測定結果見表3，繪制蘆丁質量濃度（μg/mL）與吸光度的標準曲線如圖2。結果顯示，蘆丁的標準曲線方程為Y=0.0012X+0.0031，R2=0.9997。

圖2 蘆丁質量濃度與吸光度標準曲線

2.4.2 精密度試驗

取6份同一樣品，按前述方法測定總黃酮含量，計算相對標準偏差。由表4可知，總黃酮吸光度的SRSD為2.05%，顯示精密度良好。

表4 精密度試驗測定結果（n=6）

2.4.3 穩定性試驗

取同一樣品，按前述方法測定總黃酮含量，每隔30 min進行測定，結果見表5。結果顯示，顯色反應后應在30 min內進行測定。

表5 穩定性試驗測定結果

2.4.4 重復性試驗

取同一樣品，按前述方法分別制備6份供試品溶液，測定總黃酮質量分數。由表6可知，總黃酮平均質量分數為3.83 mg/g，SRSD為2.60%，表明該測定方法的重復性良好。

表6 樣品重復性試驗測定結果（n=6）

2.4.5 回收率試驗

稱取6份樣品，每份1 g 左右，分別加入5.0 mg蘆丁標準品，按前述方法測定總黃酮質量分數，計算回收率，結果見表7，蘆丁的平均回收率為99.1%。

表7 回收率測定結果（n=6）

2.4.6 專屬性試驗

精確吸取4 mL標準品溶液、樣品溶液及空白樣品，按照1.2.3方法要求精確添加顯色劑后，分別在400～800 nm波長下進行掃描，如圖3、圖4、圖5所示，在510 nm處標準品、樣品溶液有相同的吸收峰，空白樣品在510 nm下無吸收峰，表明測定方法對羅布麻茶種的總黃酮測定具有良好的專屬性。

圖3 蘆丁標準品紫外光譜圖

圖4 樣品紫外光譜圖

圖5 空白溶液紫外光譜圖

2.4.7 耐用性試驗

考察被測溶液的質量分數對測定結果的影響。由不同實驗人員進行操作，每人均取0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 g羅布麻粉末樣品，按照1.2.3方法進行操作，測得樣品溶液在510 nm下的吸光度。從表8可以看出，隨著樣品質量分數的增加，黃酮質量分數總體呈上升趨勢。3組實驗人員檢測出的黃酮質量分數的SRSD結果表明，試驗條件具有良好的適應性。

表8 溶液質量分數對吸光度的影響

考察被測溶液的穩定性對測定結果的影響。放置0 min，10 min，20 min，30 min，40 min，50 min，1 h，3 h，5 h和7 h后，按1.2.3方法測吸光度。由表9可知，待測溶液加入顯色劑后隨著時間的延長，吸光度整體呈下降趨勢，所以顯色后應在1 h內上機完成檢測，該方法選30 min內上機檢測。

考察樣品提取時間對測定結果的影響。準確稱取1 g羅布麻茶試樣粉末，置具塞錐形瓶中，加入25 mL 70%乙醇，靜置后稱其質量，分別回流20，40，60，80和100 min，冷卻后，再稱其，剩下步驟同1.2.3“用70%乙醇補足質量”后的方法，分別添加顯色劑后在510 nm下測定吸光度，結果見表10。

表10 提取時間對吸光度的影響

2.5 樣品的測定

分別稱取不同批次的羅布麻茶粉末，各1 g，按1.2.3小節的方法和《保健食品檢驗與評價技術規范（2003版）》保健食品中總黃酮的測定方法分別進行測定，計算其總黃酮質量分數，結果見表11[18]。

表11 不同樣品測定總黃酮質量分數

結果顯示，2個方法測定的總黃酮質量分數具有較大差異，基本在1.5倍左右。紫外分光光度法檢測的是黃酮類物質特有的B環的肉桂酰基結構，這個結構是黃酮物質的主要活性部位，吸收峰在300～400 nm之間，硝酸鋁顯色法檢測的是所有具有鄰二位酚羥基結構的黃酮類化合物，吸收峰在510 nm左右。紫外分光光度法直接對樣品進行測定，具有一定的局限性，比較適合成分單一樣品的檢測，不能很好地代表羅布麻茶的品質。因為羅布麻茶中具有降血壓、降血脂等保健功效成分物質除黃酮類物質外，還含有大量其他物質，如羥基苯甲酸類、綠原酸等酚類，這些物質用紫外分光光度法是檢測不出來的[19]。

2.6 最低檢測限

按照1.2.3方法測定20次空白溶液的吸光度并計算檢測限，根據“檢測限（LOD）=3.3δ/S”計算。式中，δ表示被測液中黃酮質量分數的標準偏差；S表示標準曲線的斜率。由表12可知，最低檢測線為4 μg/mL。

表12 試驗方法得檢出限

3 結論及討論

3.1 討論

野生羅布麻（紅麻）于20世紀60年代在我國北緯33°～48°的鹽堿地域大量分布，由于人為破壞、環境惡化等原因，導致羅布麻（紅麻）至今在全國29個歷史分布區的邊緣地帶僅有零星殘存，只有全球距海岸最遠的新疆阿勒泰鹽湖東戈壁尚存82041 m2，是我國當今該植物最大的野生群落，羅布麻（紅麻）已瀕臨滅絕。因此，2006年，“拯救羅布麻 健康千萬家”工程被發起，以原生種大規模（1453 hm2）仿生種植。現已成為羅布麻（紅麻）年產干葉高達1000 t的產能基地，占我國羅布麻（紅麻）資源的90%[20]。因此確定合適檢測方法，對羅布麻（紅麻）產業的發展具有重大的意義。

3.2 結論

試驗方法的線性方程為Y=0.0012X+0.0031，R2=0.9997，線性關系良好；精密度試驗SRSD為2.05%（n=6）；穩定性試表明溶液配制好后應在30 min內上機比色；重復性試驗顯示SRSD為2.60%（n=6）；回收率試驗顯示回收率為99.1%（n=6）；專屬性試驗表明該測定方法對羅布麻茶種的總黃酮測定具有良好的專屬性；從被測溶液的質量分數、不同檢測人員及環境、被測溶液的穩定性、樣品的提取時間方面討論了檢測方法的耐用性，結果表明所設定的測定條件能夠滿足測定的需要，測定方法系統適用性良好，方法的檢出限為4 μg/mL。由此說明，用該方法測定羅布麻茶中的黃酮是可行的。

羅布麻茶用硝酸鋁顯色法進行總黃酮檢測，該方法簡便、準確、專屬性好，能夠更好地代表羅布麻茶的保健功效。