褐藻膠裂解酶研究進展

欒明鑒，何熹，林榮芳，姚艷艷，趙祥忠

1. 齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院（濟南 250353）；2. 齊魯工業大學（山東省科學院）食品科學與工程學院（濟南 250353）；3. 威海長青海洋科技股份有限公司（威海 264200）

褐藻是中國重要的經濟藻類之一，也是沿海地區重要的生物能源制造者，有超過250個屬，1800余種[1]。目前應用最多的是瓊膠、褐藻膠和卡拉膠。其中，褐藻膠在海藻工業中產量最大、品種最多、用途最廣，被廣泛應用于各種工業。褐藻膠的降解產物褐藻膠寡糖也具有許多生物活性，因此近年來受到許多科研工作者的極大關注[2]。

我們通常所指的褐藻膠是褐藻酸的鈉鹽——褐藻酸鈉，又名海藻酸鈉，廣泛存在于各種褐藻中的一類水溶性酸性多糖物質。褐藻酸鈉分子式為（C6H7O8Na）n，是由β-D-甘露糖醛酸（M）與α-L-古羅糖醛酸（G）兩種基礎物構成，通過β-1, 4-糖苷鍵相連接[3]。相對分子質量在33～250 K之間，一般為白色或淡黃色粉末，無臭無味，不溶于乙醇、乙醚、氯仿和酸（pH＜5.4），易溶于堿水，吸水膨脹變軟，成黏稠狀膠體。

褐藻膠是褐藻細胞壁的重要組分，具有分子質量大、高聚合度、高黏度及高纖維性等特征，因而人體吸收利用程度差，很大程度上限制了使用范圍[4]。人們通過科學的方法將其分解，變成可吸收利用的有效成分。褐藻膠的降解產物——褐藻膠寡糖所具有的免疫調節、抑菌、抗病毒能力等生物活性，在醫藥界具有很大的潛在價值。褐藻膠寡糖屬于低分子聚合物，是由2～10個單糖通過糖苷鍵結合而成的，具有溶解性好，穩定性強，易被機體吸收且安全無毒等特點[5]。目前有大量文獻對褐藻膠寡糖進行了深入研究和開發，使其更多的活性應用到食品、藥品、環保、化工領域中，因此具有很高的應用價值[6]。

褐藻膠裂解酶作為生產褐藻膠寡糖的工具酶，反應效率高，反應條件溫和，可控性強，便于定向制備褐藻膠寡糖，其研究具有深遠理論意義和應用前景。

1 褐藻膠裂解酶及其酶解特性

根據目前的研究結果，褐藻膠制備AOS方法分為三種：物理方法，化學方法和生物酶解方法。物理方法主要有輻射降解，熱液降解等。降解程度與溫度和時間呈正相關。缺點是降解的產物相對分子質量大，較難獲得具有生物活性價值的褐藻膠寡糖?；瘜W方法主要有酸水解、堿水解和氧化水解。但是化學方法不容易控制，耗時長，褐藻膠被降解到一定程度后，副產物多，降解產物濃度低，很難再進一步降解。而利用褐藻膠裂解酶，可大大提高低聚糖片段的產率，綠色環保?，F如今酶解法將逐漸取代傳統的化學降解法[7-8]。

褐藻膠裂解酶屬于多糖裂解酶（Polysaccharide Lyase，PLs）的一類，褐藻膠裂解酶分布于PL家族5，6，7，14，15，17，18的7個家族中。褐藻膠裂解酶還可根據酶切位點分為內切酶和外切酶兩種，大部分為內切酶。多數報道發現褐藻膠裂解酶多為poly M偏好型，少數為poly G偏好型。雖然褐藻膠裂解酶存在降解poly M或者poly G的偏好性，但不代表其不能降解非特異性的底物[9]。

褐藻膠裂解酶通過β-消除機制（β-eliminate），作用于單體間的1-4糖苷鍵，隨著糖苷鍵的消除，產物末端六元環C4和C5位會生成不飽和雙鍵，底物的非還原性末端也會生成不飽和4-deoxy-L-erythro- hex-4-enopyranosyl糖醛酸，從而使得褐藻膠降解成一系列長短不一的寡糖片段。其酶解機理如下圖所示。不論是D-甘露糖醛酸或L-古羅糖醛酸都可生成不飽和衍生物。不飽和糖醛酸在235 nm波長處有強烈的紫外吸收，因此酶活力大小可在此波長處進行測定。

圖1 褐藻膠裂解酶作用原理圖

2 影響褐藻膠裂解酶活性的因素

2.1 褐藻膠裂解酶來源

褐藻膠裂解酶的來源有很多，細菌與真菌中都存在，但大多數存在于細菌中，常見的有海洋弧菌，交替假單胞菌，鹽單胞菌，黃桿菌屬等。目前已有50多種褐藻膠裂解酶從藻類、海洋軟體動物以及土壤細菌中分離出來[10]。李婷婷等（2017）研究發現，以海藻酸鈉為唯一碳源，從天然腐爛海帶中篩選得到一株高效褐藻膠降解菌株53#，經形態學觀察和16SrRNA鑒定，確定為類芽抱桿菌Paenibacillus agaridevorans。采用正交試驗方法，以pH、溫度、NaCl濃度和海藻酸鈉初始濃度為影響因素，對該菌株的產酶條件進行優化，得到53#菌的最佳產酶條件：pH 8，25 ℃，NaCl質量濃度15 g/L，海藻酸鈉初始濃度15 g/L。在最佳產酶條件下，褐藻膠裂解酶達到最大酶活。篩選得到的類芽抱桿菌Paenibacillus agaridevorans53#具有易于培養、產酶速度快和酶活力高等優點，能夠實現褐藻膠的高效糖化，在褐藻生產生物乙醇領域具有潛在利用價值[11]。然而周敏[12]研究發現以褐藻酸鈉為唯一碳源，從海帶降解菌群、海螺、鮑魚內臟中共篩選出褐藻膠裂解酶產酶菌株共7株，其中鮑魚內臟來源的弧菌屬細菌Vibriosp. B4.活性最高。對Vibriosp. B4產褐藻膠裂解酶的發酵條件和發酵培養基進一步優化，獲得發酵培養基的最適碳源為褐藻酸鈉10 g/L，最適氮源為硫酸銨10 g/L，最適發酵條件為溫度30 ℃，接種量1%，培養基初始pH 6.0。因此可見，由于菌種的不同，培養條件不同，酶活也不盡相同。

2.2 培養條件的優化

培養條件、接種量、接種齡、培養基的各成分配比都會影響酶活性。李雙等[13]以交替單胞菌屬新種HB161718為研究菌株，在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken設計及響應面法優化獲得該菌的最佳產酶培養基：海藻酸鈉7.23 g/L，蛋白胨7 g/L，NaCl 23.11 g/L，K2HPO40.1 g/L，MgSO40.1 g/L，優化條件下酶活力達到優化前的1.59倍。

褐藻膠裂解酶在常溫、常壓和溫和的酸堿環境下，可以進行高效的催化反應。褐藻膠裂解酶本身是蛋白質，無毒，對酸堿度敏感，故可通過調節反應環境酸堿度、改變反應環境溫度或添加抑制劑（助力劑）的方法控制酶促反應進行。pH、金屬離子、溫度等因素，對于酶活有顯著影響。楊錦等[14]發現適合濃度的Mg+、K+、Fe2+對產酶起到了促進作用，這與之前的研究結果相一致。此外，菌株SH-1幾乎不能在無 K+的培養基中生長和產酶，表明K+是其生長和產酶所必需的無機鹽。Microbulbifersp. SH-1適宜生長的條件為pH 7～8.5，溫度25～32 ℃，最適產酶條件pH 7.5，溫度32 ℃，該條件溫和可控易于實現。

3 褐藻膠裂解酶分子生物學研究

決定酶活性的兩個關鍵性因素，一個是足夠的酶表達量，另一個是酶的結構決定單位酶活性。足夠的酶表達量，可以利用分子生物學的方法，將不同生物的褐藻膠裂解酶基因進行過量異源表達最為常見。其中大腸桿菌和畢赤酵母是最常見的模式菌株。酶的單位活性可以通過研究催化機制，改造蛋白質結構，進而提高酶的活性。

由于定向改造后的產酶菌株適合于工業發酵，可以滿足市場對該酶的需要，具有較大的發展前景。隨著分子生物學技術的蓬勃興起，為褐藻膠裂解酶研究提供了新的技術手段。通過基因工程技術、異源表達、蛋白質結構改造等方法對褐藻膠裂解酶進行改造，設計適用于不同工業化應用的褐藻膠裂解酶生產菌株。

3.1 褐藻膠裂解酶基因表達研究

近年來，在NCBI數據庫中已收錄多種來源的褐藻膠裂解酶基因。Masayuki等[15]在PL-7家族中，發現銅綠假單胞菌基因組中存在一個編碼與藻鞘氨醇單胞菌裂解酶A1-II同源的蛋白（PA1167）的基因。在大腸桿菌中過表達的PA1167產物降解褐藻酸鈉并釋放了不飽和糖。Zhu等[16]從深海細菌Flammevirgasp.中克隆并鑒定了一種新型的雙功能褐藻膠裂解酶FsAlgB。重組FsAlgB的特征是內切褐藻膠裂解酶，它可以識別四糖為最小底物并切割相關亞位點之間的糖苷鍵。在菌種中發現新的基因并克隆表達，是現階段褐藻膠裂解酶的基礎研究。

Yang等[17]從Microbulbifersp. Q7克隆了編碼新褐藻膠裂解酶AlyM的基因alyM并在大腸桿菌中表達。AlyM在pH 7.0和55 ℃時表現出最大的活性，并且特別偏愛聚古洛糖醛酸（polyG）。ESI-MS分析表明，AlyM主要產生聚合度（Degree of polymerization，DP）為2-5的寡糖。Li等[18]在Flavobacteriumsp. H63中發現褐藻膠裂解酶基因sag I，并對其進行密碼子優化，成功在畢赤酵母中高效表達。酵母培養上清液中sagI重組酶（rSAGL）的最高產量達到226.4 μg/mL（915.5 U/mL）。該酶的最佳反應溫度和pH為45 ℃和7.5。Yang等[19]構建重組褐藻膠裂解酶cAlyM及其熱穩定突變體102C300C，并在畢赤酵母中成功表達，鑒定結果顯示出兩種酶具有很好的熱穩定性，兩種酶在50 ℃和pH 8.0時均表現出最大活性，并且對polyG偏愛。大腸桿菌和畢赤酵母均為模式生物，但在這兩種不同的微生物系統表達中，由于過量表達而未及時折疊成有活性的結構，形成包涵體，酶活將受到不同程度的影響。這也是目前研究中遇到的難題之一，包涵體的解決，可以極大地提高異源表達的成功率。

3.2 褐藻膠裂解酶蛋白質結構研究

近年來隨著結構生物學的發展，越來越多褐藻膠裂解酶的結構及催化機制得到解析。從結構上來看，褐藻膠裂解酶通常采取3種結構：β果凍卷、（α/α）n桶狀結構和β螺旋結構。褐藻膠裂解酶通過β消除的方式來降解褐藻膠，根據催化過程中有無金屬離子的輔助，褐藻膠裂解酶的催化機制又可進一步分為His（Tyr）/Tyr型β消除和金屬離子輔助的β消除。這一理論為褐藻膠裂解酶的應用提供一定的理論依據[20]。對蛋白質結構進行定向定點的改造，可以解決褐藻膠裂解酶的低熱穩定性等一系列的問題。Yang等[21]研究發現，在這項研究中，引入二硫鍵，可以提高MicrobulbiferspQ7的褐藻膠裂解酶cAlyM的熱穩定性。與cAlyM相比，設計的兩種突變體，在45 ℃的半衰期分別增加2.25 h和1.16 h，并且在融解中分別增加1.7 ℃和0.4 ℃。這項研究中使用的合理設計策略，為提高褐藻膠裂解酶的熱穩定性，提供了一種有價值的方法。Emil等[22]從腸道細菌Bacteroides cellulosilyticus（BcelPL6）細菌中提取了6家族的褐藻膠裂解酶，將保守的催化位點殘基Lys249，Arg270和His271進行取代，導致活性喪失。Dong等[23]為了探索Aly36B的催化機理，研究并了解了野生型Aly36B及其突變體的結構?；诮Y構和突變分析，解釋了Aly36B對褐藻膠降解的催化機理。在催化過程中，Arg169，Tyr185和Tyr187負責中和底物的負電荷，而Lys143既充當催化堿又充當催化酸，代表了褐藻膠裂解酶的一種新型催化機制。定點突變這一高效改造，可以更清楚地了解催化機制的關鍵性氨基酸位點。

蛋白質的催化結構域是底物結合關鍵位點，結構域的改造是提高蛋白質活性的技術手段之一。Yan等[24]為了確定褐藻膠裂解酶中非催化結構域的功能，構建了僅包含催化結構域的重組AlgH-I和包含催化結構域和碳水化合物結合模塊（CBM）結構域的AlgH-II。結果表明，缺失相關結構域，顯著提高了重組酶的活性和熱穩定性。與改造前的酶相比，修飾后的褐藻膠裂解酶酶活更高，可用于工業生產AOS。

4 褐藻膠裂解酶的應用

4.1 食品行業

褐藻膠裂解酶在食品行業的應用是降解褐藻膠產生褐藻膠寡糖，褐藻膠寡糖的抗菌活性用于食品保鮮。虞銘霞等[25]發現在6周凍藏過程中，海藻糖和褐藻膠寡糖顯著（p＜0.05）降低了紫貽貝肉解凍損失率，肉組織結構相對較為完整、致密，細胞間隙冰晶顆粒面積較小，并維持了較好的彈性和咀嚼性等特性，同時有效抑制了紫貽貝肉中菌落總數的快速增加。因此海藻糖和褐藻膠寡糖可作為一種高效的低溫保護劑，用于保持紫貽貝及其制品品質及延長凍藏產品貨架期。陳淑瓊等[26]研究結果顯示，褐藻膠寡糖具有較強的清除自由基的能力和抑菌能力，將其作用于蝦頭中提取的多酚氧化酶，發現能有效地抑制多酚氧化酶的活性，表明褐藻膠寡糖對對蝦的腐敗菌生長具有一定的抑制作用，為酶解褐藻酸鈉制備的褐藻寡糖的開發和對對蝦的貯藏保鮮研究提供了理論依據?？寡趸赃@一特性對食品保鮮，延長貨架期提供了理論依據。

4.2 醫藥行業

褐藻膠裂解酶在醫藥領域的應用目前是抗生物膜劑的制備。銅綠假單胞菌是一種機會性致病病原體，臨床上最常見的三大致病菌之一，是免疫受損個體和肺囊性纖維化患者主要致病因子。銅綠假單胞菌侵入肺上皮后，從非褐藻膠產生菌株（非黏液型）到褐藻膠產生菌株（黏液型）的遺傳轉化，有利于細菌生物膜的形成并粘附在肺黏膜并發生細菌的免疫逃逸，導致臨床上出現持續性，難治性感染。王亞男[27]利用96孔板模型和flow cell模型檢測，A1y08對銅綠假單胞菌生物膜具有抑制和清除作用。為了進一步改善褐藻膠裂解酶生物學特性和抗生物膜活性，以離子交聯法將純酶A1y08固定在殼聚糖（CS-NPs）上構建納米粒。褐藻膠裂解酶A1y08具有較高活性及較好的溫度穩定性和堿適應性以及高效降解褐藻膠底物的能力，同時固定化的褐藻膠裂解酶-殼聚糖納米粒，將有助于褐藻膠裂解酶作為抗生物膜劑的進一步開發。這一應用對細菌性肺部感染提供了新的治療方法。

5 結語與展望

綜上所述，褐藻膠裂解酶具有極高的應用價值，能夠適用于各個行業，長久以來受到國內外研究者的關注。隨著基因工程技術的發展，基因工程技術將成為研究褐藻膠裂解酶的關鍵技術。因此，根據來源不同的褐藻膠，篩選出相應的產酶菌株，建立褐藻膠裂解酶的菌種庫；應用研究褐藻膠裂解酶的活性機理，以便利用，可以更好地應用其特點造福人類；在對菌株產酶特異性研究的基礎上，應用現代生物技術手段，對菌株的產酶種類、產酶效率進行分子層面的改造，提高其產酶活性和穩定性，以達到酶制劑工業化的需要，構建高效率的工程菌株；應用發酵工程、蛋白質工程、基因工程和酶工程技術，生產工具專用酶，酶解褐藻膠，開發具有特殊功能的褐藻寡糖，為海洋資源的高附加值化的開發，探索新的途徑。以上幾個方面將是褐藻膠裂解酶未來的研究方向。