戊唑醇對不同釀酒酵母模擬發酵過程中葡萄酒風味品質的影響

趙珊珊, 李敏敏, 李瑞瑆, 全 蕊, 陳捷胤,戴小楓, 孔志強*,, 田 健*,,4

(1. 河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071001；2. 中國農業科學院 植物保護研究所，北京 100193；3. 中國農業科學院 農產品加工研究所，北京 100193；4. 中國農業科學院 生物技術研究所，北京 100081)

葡萄是釀造葡萄酒的主要原料，但因葡萄種植過程中霜霉病、炭疽病、白腐病、灰霉病和白粉病等病害多發，在生產種植過程中需大量使用殺菌劑[1]。研究人員對葡萄及葡萄酒樣品抽檢發現，葡萄酒中三唑類殺菌劑檢出率較高，其中戊唑醇被廣泛檢出，其含量在0.002～0.298 mg/kg之間[2-3]。戊唑醇因具有殺菌譜廣、活性強和持效期長等優點而在葡萄種植過程中大量使用，但由于其持效期長頻頻引發葡萄及葡萄酒中農藥殘留事件[3-4]。農藥殘留不僅帶來食品安全問題，同時還會造成葡萄酒品質降低、風味物質改變[5-6]。研究發現，釀酒酵母等微生物在發酵過程中對殘留農藥造成化學和生物性降解，酵母細胞壁中的多糖、蛋白質等可提供多種功能基團，例如羧基、羥基、巰基、磷酰基和氨基等，可參與結合農藥等有害物質[7]，使發酵后葡萄酒中大部分農藥殘留水平改變[8-10]，甚至產生比母體毒性更大的物質，例如酵母可將殘留的三唑酮代謝生成比母體毒性更大的三唑醇[11]。另一方面，農藥殘留在影響葡萄酒安全性的同時，也會使葡萄酒發酵過程延緩，并且對酵母細胞造成不同程度的損傷[8,12]，從而造成葡萄酒風味品質的改變。Cabras等[13]指出，滅菌丹可以完全抑制酵母菌Saccharomyces cerevisiae和Kloeckera apiculata的發酵作用，González-álvarez等[14]研究發現，氰霜唑、噁唑菌酮和雙炔酰菌胺可對白葡萄酒中6種芳香類物質的含量造成一定的影響。

目前，葡萄酒釀制過程中農藥殘留研究主要集中在殘留分析方法開發及葡萄酒加工過程中單一釀酒酵母對農藥殘留的影響和風味干擾[15-17]，缺乏系統研究不同釀酒酵母對葡萄酒釀酒過程中農藥殘留的影響，尚未見關于戊唑醇殘留干擾葡萄酒發酵過程后風味物質研究報道。為此，本研究通過利用不同釀酒酵母模擬葡萄酒酒精發酵過程，系統評價其對戊唑醇殘留的影響，同時利用電子感官評價系統明確戊唑醇殘留是否造成風味品質差異，進而通過SPME-GC-MS明確戊唑醇殘留對酒精發酵后葡萄酒揮發性風味物質造成的影響。旨在明確對戊唑醇降解作用效果明顯且能夠穩定保持葡萄酒風味品質的釀酒酵母，為葡萄酒釀造菌株的選擇提供參考，同時為葡萄酒生產過程中安全評價提供科學數據支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

戊唑醇 (tebuconazole) 標準品 (德國Dr. E公司，純度>99%)；分析純氯化鈉和無水硫酸鎂 (國藥集團化學試劑有限公司)；色譜純二甲基亞砜(DMSO)、乙腈 (美國Thermo Fisher Science公司，純度>99.5%)；分散凈化劑N-丙基乙二胺 (PSA，博納艾杰爾科技有限公司)；葡萄酒果酒釀酒酵母(文中簡稱帝伯仕，煙臺帝伯仕酵母有限公司)；釀酒酵母：71B、2323、AC、BO213、RC212、D254、EC1118、F15、F33、KD和X16 (法國LAFFORT公司)；模擬葡萄汁培養基 (MSM medium base，招遠拓普生物工程有限公司)。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290超高效液相色譜儀和Agilent 6470三重四極桿質譜檢測器 (美國Agilent公司)；Eclipse PlusC18 RRHD色譜柱 (2.1 × 50 mm，1.8 μm，美國Agilent公司)；PEN3.5型電子鼻 (德國Airsense公司)，是由W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W和W3S等10個金屬氧化物氣敏傳感器組成的陣列傳感器；AsrreeⅡ/LS16型電子舌 (法國Alpha MOS公司)，由7個化學選擇性區域效應的味覺傳感器和1個Ag/AgCl參比電極組成，對酸、咸和鮮3種基本味覺呈味物質都有響應；GC-MS QP2010 plus氣相色譜-質譜聯用儀 (日本島津國際貿易有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 模擬葡萄酒酒精發酵 模擬葡萄汁培養基可以模擬葡萄汁成分，適于研究葡萄酒酵母的發酵特性，并且在本研究中可以克服真實葡萄原料本身含有的外源性農藥以及其他葡萄酒加工工藝帶來的影響，使試驗具有更佳的重現性[18-20]。

模擬葡萄汁培養基：稱取MSM培養基207.0 g于1 L超純水中，混勻，用5.0 mol/L 的氫氧化鈉調節pH值至3.3，在超凈臺中用0.22 μm一次性水系針頭式過濾器除菌，現配現用。

1.3.1.1 酵母活化 將12種活性干酵母分別溶于50倍體積的2%蔗糖水中，在32 ℃水浴中復水活化20 min，酵母接種量為10 g/50 L。

1.3.1.2 模擬葡萄酒發酵處理 共設A、B、C 3組試驗：戊唑醇對照 (A組)，僅添加戊唑醇標準溶液至2 mg/L，共1個處理。酵母對照 (B組)，分別添加12種酵母活化液，不添加戊唑醇標準溶液，共12個處理。試驗組 (C組) 根據GB 2763—2019中戊唑醇在葡萄中的最大殘留限量，在模擬葡萄汁中添加戊唑醇標準溶液的質量濃度為2 mg/L[21]，添加后靜置30 min，再添加釀酒酵母活化液，共12個處理。3組試驗中每個處理重復3次。處理后的模擬葡萄汁經酒精發酵 (25 ℃ ± 1 ℃，7 d) 后采集發酵液進行分析[22-24]。

1.3.2 模擬葡萄酒發酵液中農藥殘留測定

1.3.2.1 樣品前處理 取5.0 mL發酵液至15 mL離心管中，加入5.0 mL乙腈，渦旋振蕩2 min；加入4.0 g 氯化鈉和1.0 g無水硫酸鎂，渦旋振蕩1 min后于5 000 r/min下離心5 min；取上清液1.0 mL，轉移至含有50 mg PSA和150 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中，渦旋振蕩1 min后于6 000 r/min下離心1 min；取上清液，過0.22 μm有機相濾膜，待測。

1.3.2.2 儀器檢測條件

色譜條件：流動相A為體積分數為0.05%的甲酸水溶液；B相為乙腈，流速0.4 mL/min，進樣量2 μL。梯度洗脫程序：0～1 min，90% A；>1～4 min，15%～90% A；>4～5 min，1%～15% A；>5～6 min，1% A；>6～6.20 min，1%～90% A；>6.20～7 min，90% A；分析時間7 min。

質譜條件：采用電噴霧離子源正離子模式，干燥氣溫度為300 ℃，干燥氣流量為5 L/min；霧化氣壓力為3.1 × 105Pa；鞘氣溫度為250 ℃，鞘氣流量為11 L/min；毛細管電壓為 (正) 4 000 V、(負) 3 500 V；噴嘴電壓為 (負) 1 500 V；母離子選擇308.2m/z，子離子選擇123、70.1m/z，破裂電壓為112 V，對應的碰撞能量為37和21 eV。

1.3.3 模擬葡萄酒發酵液電子鼻風味分析 準確量取3.0 mL發酵液于進樣小瓶中，在25 ℃ ± 1 ℃下靜置10 min，使樣品揮發性氣體充滿氣質瓶頂空空間，每個樣品重復3次。電子鼻開機后進3針空氣樣品，待儀器穩定后開始檢測樣品，檢測過程中，傳感器自動清洗時間為180 s，樣品測試分析時間為60 s。采用電子鼻WinMuster系統進行載荷分析 (Loading analysis)[25-26]，數據采用區間選擇較為穩定的35～39 s。

1.3.4 模擬葡萄酒發酵液電子舌滋味分析 準確量取20.0 mL發酵液，用超純水稀釋至150.0 mL，封口膜密封后超聲處理20 min，過0.22 μm水相濾膜；取100.0 mL至進樣燒杯中進行檢測，電子舌開機后活化傳感器，建立樣品分析表，樣品燒杯與超純水燒杯依次間隔擺放在樣品盤上，在樣品盤上添加完樣品后開始進行電子舌掃描檢測，每采樣1次，傳感器進入超純水清洗1次。為了避免初始檢測響應信號不穩定，每個樣品重復掃描檢測7次，在獲得分析數據后，摒除前3次數據，只采用后4次穩定的電子舌響應數據。運用電子舌自帶分析軟件進行味覺差異分析。

1.3.5 主要風味物質SPME-GC-MS定性分析 準確量取3.0 mL發酵液于20 mL頂空瓶內，采用固相微萃取方法提取易揮發性化合物，再通過氣相色譜-質譜聯用儀對這些化合物進行分離并分析。運用NIST11數據庫對未知揮發性化合物譜圖進行比對定性[27]。

1.3.5.1 固相微萃取條件 將樣品置于50 ℃下平衡20 min，用65 μm PDMS/DVB萃取頭插入頂空瓶中萃取40 min后拔出并置于200 ℃的進樣口中解吸2 min。

1.3.5.2 色譜-質譜條件 DB-WAX色譜柱 (30 m ×0.25 mm，0.25 μm)，柱溫箱初始溫度40 ℃，進樣口溫度200 ℃，不分流進樣，載氣流速1 mL/min，柱溫箱升溫程序為40 ℃保持3 min，5 ℃/min升至120 ℃，10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min。離子源溫度為200 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，采用全掃描 (Scan) 模式采集信號，掃描范圍m/z35～500。

2 結果與分析

2.1 不同酵母對農藥殘留降解影響

2.1.1 標準溶液配制及標準曲線建立 準確稱取一定量戊唑醇標準品，用DMSO溶解，配制成1 000 mg/L的戊唑醇標準儲備液。按1.3.2.1節中樣品前處理的方法，用空白模擬葡萄汁發酵液基質溶液稀釋戊唑醇標準儲備液，配制成0.05、0.1、0.5、1和2 mg/L的系列戊唑醇基質匹配標準溶液。以峰面積為縱坐標，以相應的戊唑醇濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到的標準曲線線性方程為：y= 101x+ 1 033.1，R2= 0.999 4，表明戊唑醇在0.05～2 mg/L范圍內線性關系良好。

2.1.2 殘留分析方法驗證 向空白模擬葡萄汁發酵液中分別添加0.05、0.1和0.5 mg/L 3個水平的戊唑醇標準溶液，渦旋2 min，靜置2 h，每個水平重復5次。按1.3.2.1節樣品前處理方法進行處理，回收率在102%～105%，相對標準偏差 (RSD)為0.80%～4.5%，方法檢出限 (LOD) 為0.015 mg/L，定量限 (LOQ) 為0.05 mg/L，表明該方法的準確度和精密度滿足農藥殘留分析的要求[28]。

2.1.3 不同釀酒酵母對戊唑醇殘留降解效果 由圖1可知：模擬葡萄汁經不同釀酒酵母發酵后，葡萄酒中戊唑醇含量均有不同程度的降低，降解率在10%～23%之間，而未添加酵母菌的模擬葡萄汁 (CK) 戊唑醇含量沒有發生顯著變化，說明釀酒酵母對戊唑醇有一定的降解作用。D254、RC212、BO213和AC對戊唑醇降解效果相對優于其他釀酒酵母菌株 (P< 0.05)，降解率超過20%，分別為22.9%、21.9%、21.6%和21.3%。帝伯仕釀酒酵母對戊唑醇降解率顯著低于其他11種酵母菌 (P<0.05)，僅有10.1%；2 323、F33和F15也表現出較低水平的降解作用，且顯著區別于D254和RC211。

2.2 電子鼻載荷分析

PEN3.5電子鼻共有10個金屬氧化物氣敏傳感器 (W1C對苯類芳香成分敏感；W5S對氮氧化合物敏感；W3C對芳香胺類成分敏感；W6S對氫氣、氫化合物敏感；W5C對烷烴芳香成分敏感；W1S對甲基類敏感；W1W對硫類化合物敏感；W2S對醇類及芳香族化合物敏感；W2W對芳香成分和有機硫化物敏感；W3S對烷烴類敏感)。對B、C兩組樣品進行載荷分析，從而判斷各傳感器在兩組樣品揮發性風味物質差異分析中的貢獻率。結果如圖2所示，第1主成分的貢獻率為94.01%，第2主成分的貢獻率為4.59%。載荷的絕對值越大，對主成分影響越大[29]。從中可看出，在本次模擬葡萄酒發酵液的氣味識別中，W1W傳感器對PC1和PC2的貢獻率最大，其次是W1S傳感器，另外W2W傳感器在PC1的區分發揮較大作用，說明第一主成分主要反映的是硫類、甲基類和芳香類化合物。W1C、W3C和W2S所測數據點位置較為聚集，因此發揮作用較為相似，反映芳香類化合物對主成分的貢獻。W5C、W6S和W3S測得數據點較接近且在主成分1、2中的載荷值均靠近0，故對樣品間的區別貢獻不大，即本次模擬發酵產生的香氣物質中烷烴類并未表現出明顯差異。因此可初步判定，葡萄酒發酵受戊唑醇影響后，可能在芳香類化合物、含硫化合物和甲基類化合物等風味物質類群產生較大變化。

2.3 電子舌滋味分析

滋味是評價葡萄酒品質的重要指標，電子舌分析系統中，AHS為酸味傳感器，SCS為苦味傳感器，ANS為甜度傳感器，NMS為鮮味傳感器，CTS為咸味傳感器，CPS與PKS為通用傳感器。通過電子舌系統對B、C兩組樣品的呈味成分進行檢測分析，將組間與組內的檢測結果分別進行比對。表1為同種酵母在B、C兩組不同處理下表現出的7個傳感器綜合分析下的味覺風味差異。12種酵母菌中有8種使其B、C兩組樣品的味覺風味在7個傳感器綜合評價下差異值達到90以上，另外4種酵母 (AC、F15、EC1118、RC212)差異值均在80以下，受戊唑醇影響最小的是AC，為22.1。圖3為酵母AC發酵液的味覺分析對比圖，從中也可以看出其傳感器響應值的相似度極高。

表1 各模擬發酵液味覺差異表Table 1 Differences in taste of each simulated fermentation broth

2.4 SPME-GC-MS分析

分別對B、C兩組發酵液樣品進行SPME-GC-MS檢測分析，檢出物質的匹配度大于或等于80的具有參考意義，共檢出63種揮發性成分。其中，醇類18種，酯類22 種，酸類7種，烷類6種，其他10種。首先，乙醇、異戊醇、(2R,3R)-(－)-2,3-丁二醇、正己酸乙酯、辛酸乙酯和正癸酸乙酯在所有樣品中均被檢出。苯甲醇只在所有酵母對照(B組)樣品中檢出，而B組樣品是沒有經過戊唑醇處理的模擬葡萄酒發酵液，說明戊唑醇殘留對發酵葡萄酒中苯甲醇產生一定抑制作用，而苯甲醇在葡萄酒中呈苦杏仁味、脂肪味，是一種重要的芳香醇類物質。其次，戊唑醇使2323、RC212、71B、D254、BO213、AC和KD 發酵下的7種發酵液生成呈菠蘿香氣的庚酸乙酯，抑制酵母菌F33、X16、RC212、71B、AC、帝伯仕釀酒酵母產生呈水果香氣的辛酸異戊酯，抑制酵母菌F33、X16、2323、RC212、71B、D254、AC、KD、帝伯仕釀酒酵母生成苯甲醇 (苦杏仁味、脂肪味)、苯乙醇(清甜玫瑰香)、癸酸3-甲基丁酯、9-十六碳烯酸乙酯。另外異戊酸 (甜潤果香味、篤斯越橘味)、正己酸 (干奶酪氣味、汗臭味) 等物質的生成也受到一定影響。Noguerol-Pato等[30]發現，戊唑醇可能會刺激葡萄酒發酵過程使之產生葡萄品種香、醇香、花香氣味，減少梨香、熱帶水果和蔬菜系列氣味。本研究結果與之基本一致。

進一步研究發現，12種釀酒酵母中，AC菌株發酵的B、C組兩樣品間相同物質的數目最多，其峰重合度最高 (圖4)，表2中為SPME-GCMS檢測AC菌株模擬發酵下葡萄汁發酵液的主要揮發性成分表，酵母對照B組 (B-AC) 檢出22種物質，戊唑醇處理的C組 (C-AC) 檢出15種物質，共有14種相同成分，說明在模擬發酵過程中，AC菌株發酵產生的揮發性物質受戊唑醇影響最小，此結果與電子舌分析結果一致。

表2 酵母菌AC模擬葡萄汁發酵液發酵產生主揮發性成分Table 2 AC simulates the main volatile components produced by fermentation of grape juice fermentation broth

3 結論與討論

殘留在葡萄中的殺菌劑會隨加工過程轉移到葡萄酒中[10,31]。葡萄酒不同加工過程會影響農藥殘留的水平和分布[32]。本研究采用模擬葡萄汁培養基模擬葡萄酒酒精發酵過程，系統研究不同酵母菌發酵對戊唑醇降解的影響。結果發現，所選酵母菌對戊唑醇的降解率在10%～23%之間，其中D254、RC212、BO213和AC對戊唑醇降解效果優于其他釀酒酵母菌株 (P< 0.05)，而帝伯仕釀酒酵母則對戊唑醇降解效果不明顯，降解率低于15%。該結果與前人研究結果相似[9,33]。戊唑醇降解率的大小差異可能是由于釀造條件的不同造成。

殘留在葡萄酒中的農藥會影響酵母菌的正常生長代謝從而造成葡萄酒風味品質的變化。前人研究發現，嘧霉胺、季銨鹽類殺菌劑、50%烯酰嗎啉水分散劑[34]和百菌清[35]會影響酵母的發酵速率、延長發酵時間，影響CO2和酒精等生成量；氧樂果、殺螟硫磷和三唑酮對葡萄酒發酵過程影響并不大，只是在一定程度上縮短了發酵時間[15]。即不同農藥類型會選擇性影響酵母菌群。而葡萄酒香氣大部分來自發酵階段產生的香味物質，殺菌劑可以通過抑制微生物發酵活性干擾葡萄酒釀制，從而造成發酵過程中微量成分代謝及含量差異，導致對葡萄酒感官質量的不良影響，進而降低葡萄酒香氣的純正度和口感的協調性[36-38]。本研究中，利用電子舌和電子鼻系統，對添加戊唑醇后不同酵母菌在模擬葡萄汁培養基中發酵產生的風味品質進行區分。結果顯示，戊唑醇會影響酵母菌發酵過程，從而帶來香氣產物的差異，12種酵母菌產生的香氣物質均受到不同程度的影響。

基于SPME-GC-MS分析發現，與酵母對照B組樣品相比，戊唑醇處理的C組樣品均未檢測出苯甲醇，造成風味缺失，12種酵母菌中，AC菌株表現出較為穩定的產香性能，且成品酒可較好保持葡萄品種香，具有起酵快、發酵溫度范圍大的特點，是釀酒常選菌種。另外，12種酵母菌發酵產生的香氣物質受到戊唑醇殘留的影響不同，這可能是由于酵母菌本身對戊唑醇的敏感性不同。Mulero等[5]研究發現，喹氧靈處理過的葡萄發酵后酚類化合物顯著高于對照組，肟菌酯處理的葡萄酒總酚含量 (包括二苯代乙烯類) 明顯低于對照組，經甲基醚菌酯、噁唑菌酮和氟喹唑處理過的葡萄酒發酵后總酚含量微有下降。Noguerol-Pato 等[39]用抗真菌劑處理格拉西亞諾，成品酒中揮發性化合物 (單萜和C13-降異戊二烯衍生物) 和醛類物質含量顯著增加，醋酸鹽和芳香醇的濃度降低，這些結果同樣驗證了殺菌劑與酵母菌發生作用時的相互選擇性。葡萄酒釀造中微生物發酵是一個極其復雜的過程，生產中葡萄酒中的農藥殘留種類不單一且受野生菌株影響，因此未來應繼續對殺菌劑與酵母之間的相互選擇帶來的影響進行深入探究，并且應考慮加工工藝條件差異對葡萄酒風味品質產生的影響。