6種活性多糖的結構、性質及其抗氧化活性的比較研究

王帥，趙冬雪，韓成鳳，王曉麗，李健，張樂樂，陳旎，韓培培

（省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

多糖是由多個單糖分子失水縮合后，經過特定糖苷鍵依照一定順序連接而成的線性或分支的聚合物，是一類分子結構復雜的生物大分子[1]。通常將可以調節人體生理功能的特異性多糖稱為活性多糖，通常具有抗氧化、抗輻射、免疫調節和抗腫瘤等多種生物活性[2-3]?；钚远嗵菑V泛存在于植物和大型真菌中。真菌多糖具有消耗資源量相對較小的特點，在國際上具有很大的影響力。另外，我國藻類植物的資源十分豐富，利用藻類多糖可生產出許多高價值的產品。為研究多糖的結構和性質對其抗氧化活性的影響，本文選取了4種藻類和2種真菌進行了研究，分別為地木耳（Nostoc commune）、葛仙米（Nostoc Sphaeroids）、發菜（Nostoc flagelliforme）、螺旋藻（Spirulina）、香菇（Lentinus edodes）和茯苓（Poria cocos），并對其進行了多糖的提取純化。

地木耳、葛仙米、發菜3種植物同屬藍藻門（Cyanophyta），念珠藻科（Nostocaceae），念珠藻屬（Nostoc Vanch）。螺旋藻屬于藍藻門（Cyanophyta），藍藻綱（Cyanophyceae），顫藻科（Oscillatoriaceae），螺旋藻屬（Spirulina）。香菇又稱香覃、花菇、椎耳、冬蒸、香信、厚菇，屬于擔子菌綱（Basidaiomycetes），傘菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomatacete），香菇屬（Lentinus）。茯苓分為菌絲體和菌核兩大類，它和香菇多糖同屬于擔子菌綱（Basidiomycetes）。它是非褶菌目（Aphyllophorales），多孔菌科（Polyporaceae）的一種真菌。研究發現，地木耳多糖具有一定的體外抗氧化活性[4]。葛仙米多糖對超氧陰離子自由基和羥基自由基具有很強的清除作用，且呈量效關系[5]。發菜多糖具有抗氧化、抗腫瘤以及提高免疫等生物功能，有相當可觀的藥用價值。在魚漢堡中添加螺旋藻多糖可以改善其營養成分組成[6]。香菇多糖在提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗肝炎、抗氧化方面均具有很好的藥理作用[7]。茯苓多糖具有抗氧化、抗凝血、抗病毒、降血壓、降血脂等多重藥理作用。

本研究選用4種藻類多糖（發菜多糖、地木耳多糖、葛仙米多糖和螺旋藻多糖）和2種真菌多糖（香菇多糖和茯苓多糖）作為研究對象，通過對比分析研究多糖的黏度、分子量、單糖組成等結構、性質對其抗氧化活性的影響，為多糖抗氧化活性的目的性篩選提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

發菜細胞（TCCC11757）：天津科技大學生化工程研究室；螺旋藻多糖：江西新大澤螺旋藻實業公司。葛仙米多糖、地木耳多糖：寧夏香草生物技術有限公司；香菇多糖、茯苓多糖：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

濃硫酸、氫氧化鈉、剛果紅、甲醇、正丁醇、氯仿、無水乙醇、氯化鈉、重蒸酚（均為分析純）：天津市北方天醫化學試劑廠；氘標記琥珀酸、吡啶、甲氧基銨鹽酸鹽（均為色譜純）：日本富士通有限公司；DEAE-650M、葡聚糖凝膠G-100樹脂、AB-8大孔吸附樹脂：日本TOSOH公司；T系列多糖標準品：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Size 75烏氏粘度計：美國Cannon Instrument公司。UV-mini1246紫外可見分光光度計：日本島津公司；Infinite M200 Pro多功能酶標儀：瑞士Tecan公司；F-7000熒光分光光度計：日本日立公司；1200高效液相色譜儀：德國安捷倫公司；7000B氣質聯用儀：美國安捷倫公司；IS50傅立葉紅外光譜儀：美國尼高利公司；SU1510掃描電子顯微鏡：日本電子公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖提取測定與純化

1）提?。翰捎盟岽汲练╗8]進行提取。2）含量測定：采用苯酚-硫酸法測定[9]。3）分離純化：采用Sevage法脫蛋白；AB-8大孔吸附樹脂脫色；DEAE-650M離子交換柱層析純化，葡聚糖凝膠G-100柱層析純化[10]。

1.3.2 多糖的分子量測定

采用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）檢測。

1.3.2.1 標準曲線的制作

將己知分子量的T系列多糖標準品，分別用流動相配制成1 mg/mL的溶液，進樣量20 μL，記錄各自保留時間，用Excel軟件對葡聚糖相對分子質量的對數lgMw（y）對保留時間tR（x）作圖，繪制標準曲線。標準曲線為 y=-0.269 1x+8.822 1，R2=0.999。

1.3.2.2 樣品的測定

稱取多糖樣品，用流動相溶解配成濃度為1 mg/mL的溶液，離心取上清液，進樣量為20 μL，記錄多糖出峰時間，對照標準曲線，根據回歸方程計算多糖樣品的分子量。

1.3.2.3 色譜條件

采用TSK-GEL G4000 PW XL凝膠柱（7.8 mm×30.0 cm），檢測器為RI-101示差折光檢測器，流動相為超純水，流速設定為0.5 mL/min，柱溫設定為35℃，進樣量為 20 μL。

1.3.3 特性黏度測定

特性黏度采用烏式粘度計[11]測定。

1.3.4 單糖組成的測定

單糖組成參考文獻[12-13]的方法。

1.3.5 電鏡掃描

取少量多糖樣品固定到導電膠上，對其進行噴金處理，最后進行掃描觀察。

1.3.6 三股螺旋結構的測定

采用剛果紅實驗[14]法測定三股螺旋結構。

1.3.7 紅外光譜分析

稱取干燥的多糖樣品1mg，與適量（100mg～200mg）干燥的溴化鉀粉末在瑪瑙研缽中快速且輕輕地研磨直至均勻，利用壓片機將其制成均勻透明的薄片，然后用IS50型傅立葉紅外光譜儀在4 000 cm-1～400 cm-1區間掃描。

1.3.8 多糖抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除能力測定：參考Fan等[15]的方法。

ABTS+自由基清除能力、還原能力測定：參考Shimada[16]等的方法。

1.4 數據分析

利用SICMA-P對數據進行多元統計分析，其中差異權重貢獻值（variable importance plot，VIP）圖閾值＞0.5，尋找顯著影響多糖生物活性的相關因素。

2 結果與討論

2.1 多糖的分離純化

采用水提醇沉法提取多糖、Sevage法脫蛋白、AB-8大孔吸附樹脂脫色、DEAE-650M離子交換柱和葡聚糖凝膠G-100柱層析法對發菜多糖、地木耳多糖、葛仙米多糖、螺旋藻多糖進行分離純化。粗多糖的洗脫曲線見圖1。

圖1 4種粗多糖的DEAE-650M離子交換柱層析洗脫曲線Fig.1 DEAE-650M ion exchange column chromatography elution curve of four crude polysaccharides

由圖1可知，地木耳多糖、發菜多糖、葛仙米多糖以中性多糖為主，螺旋藻多糖以酸性多糖為主，分別收集洗脫峰較大的組分。采用凝膠柱層析進一步將上述初步純化的多糖進行分離，其洗脫曲線如圖2所示。

圖2 多糖葡聚糖凝膠G-100柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of polysaccharides on Sephadex G-100 chromatography column

由圖2可知，6種多糖樣品經純化后均得到一種單一組分，收集相應組分，濃縮之后進行透析，最后真空冷凍干燥。將獲得的發菜多糖、地木耳多糖、葛仙米多糖、螺旋藻多糖-1、螺旋藻多糖-2、螺旋藻多糖-3分別命名為 FC、DZT、GZT、LXZ-1、LXZ-2、LXZ-3。采用透析法對高純度的香菇多糖和茯苓多糖進行簡單純化，各得到1種純化多糖，將香菇多糖和茯苓多糖分別命名為XG和FL。

2.2 多糖結構與性質

2.2.1 多糖分子量

在多糖結構和活性的研究中，多糖的分子量大小非常重要。利用HPGPC法測定8種純化多糖的分子量，結果如表1所示。

表1 8種純化多糖分子量Table 1 Molecular weight of eight kinds of purified polysaccharides

由表1可知，8種多糖中DZT的分子量最大，XG的分子量最小。

2.2.2 特性黏度

8 種多糖 FC、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2、LXZ-3在水溶液中的特性黏度見圖3。

圖3 8種純化多糖溶液的特性黏度Fig.3 The intrinsic viscosity of eight kinds of purified polysaccharides

由圖 3 可知，8 種多糖 FC、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2、LXZ-3在水溶液中的特性黏度分別為20.42、7.00、7.94、36.60、48.53、19.41、12.00、16.98 dL/g。DZT、GZT、FC這3種純化多糖在水溶液中的特性黏度明顯高于其他5種多糖。結合多糖的分子量測定結果，8種多糖中DZT的分子量和特性黏度最大，XG最小，且LXZ-1、LXZ-3、LXZ-2這3種多糖的特性黏度和分子量都越來越小。有研究發現，多糖溶液特性黏度與分子量大小有關[17]，由特性黏度和分子量的結果也表明，多糖的特性黏度隨分子量的增大而增大。

2.2.3 單糖組成

采用氣相色譜質譜聯用儀（Gas Chromatographic Mass Spectrometer，GC-MS）對8種純化多糖的單糖組成摩爾百分比的分析結果見表2。

表2 8種純化多糖的單糖組成摩爾百分比Table 2 The mole percent of monosaccharide composition of eight kinds of purified polysaccharides %

由表2可知，FC由木糖、核糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸5種單糖組成，各單糖的摩爾比是0.78∶0.28∶1.00∶2.44∶0.35；XG 由木糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸6種單糖組成，各單糖的摩爾比是 0.57∶1.09∶0.55∶0.82∶1.00∶66.08；FL 由半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸3種單糖組成，各單糖的摩爾比是1.00∶244.02∶0.85；GZT 由木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖4 種單糖組成，各單糖的摩爾比是 2.22∶1.06∶1.00∶0.74；DZT由木糖、鼠李糖、果糖、巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸8種單糖組成，各單糖的摩爾比是0.73∶0.27∶0.29∶0.18∶0.40∶1.00∶5.13∶1.04；LXZ-1、LXZ-2、LXZ-3的單糖組成比較相近，均由木糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖、果糖、巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸這10種單糖構成，但其單糖比例不同，LXZ-1中上述10種單糖的單糖摩爾比是0.14∶0.01∶0.01∶0.02∶0.04∶0.01∶0.01∶1.00∶0.27∶0.01，LXZ-2 中上述 10 種單糖的單糖摩爾比是 0.14∶0.01∶0.01∶0.02∶0.05∶0.01∶0.01∶1.00∶0.27∶0.01，LXZ-3 中上述 10 種單糖的單糖摩爾比是 0.04∶0.01∶0.01∶0.03∶0.02∶0.01∶0.01∶1.00∶0.11∶0.01。此外，FC、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2 和 LXZ-3 的單糖組成中都有半乳糖和葡萄糖，半乳糖和葡萄糖摩爾比分別是 1.00∶2.44、1.00∶66.08、1.00∶244.02、1.00∶0.74、1.00∶5.13、1.00∶0.27、1.00∶0.27、1.00∶0.11。

2.2.4 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察

8種多糖的掃描電子顯微鏡觀察結果見圖4。

圖4 多糖的掃描電子顯微鏡觀察圖Fig.4 SEM observation of polysaccharides

由圖4可知，觀察8種純化多糖的電鏡圖發現，FC的表面是不規則的小球狀結構，直觀地說明了發菜多糖為無定形結構；XG、FL、GZT、LXZ-1、LXZ-3 都是表面具有孔狀的疏松片狀結構，LXZ-2是有規則性小球狀和塊狀的結構，DZT是表面褶皺的片狀結構。這些差異可能與其理化性質、分子量及結構有關。

2.2.5 紅外光譜分析

8種多糖的紅外光譜圖見圖5。

圖5 多糖的紅外光譜圖Fig.5 IR spectra of polysaccharides

由圖5可知，8種多糖存在相近的多糖特征峰。8種多糖樣品在3 420 cm-1附近均具有強且寬的特征吸收峰，表明多糖存在分子間和分子內氫鍵，這個吸收峰是由糖類-OH官能團的伸縮振動引起的[18]；在2 927 cm-1、2 854 cm-1處的吸收峰是糖類物質的特征吸收峰，表明多糖存在C-H伸縮振動；1 650 cm-1附近的吸收峰是C=O的伸縮振動；1 035 cm-1是葡萄糖的特征吸收峰，說明多糖含有葡萄糖，這與多糖的單糖組成結果相符合。FC、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2和LXZ-3這8種純多糖均有上述區域的特征吸收峰。GZT、DZT在1 730 cm-1附近的吸收峰是羧基（COO-）的伸縮振動特征峰。XG、FL、FC和GZT在1 153 cm-1附近的吸收峰是環上碳-氧（C-O）吸收峰。XG、FL、FC在865 cm-1附近的特征吸收峰，是由β-D-吡喃糖C-H的變角振動所引起的，這說明這3種多糖中均含有β-D-吡喃葡萄糖環，分子以β-糖苷鍵連接為主[19]。

2.2.6 三股螺旋結構的測定

8種純化多糖與剛果紅形成的絡合物的最大吸收波長隨NaOH溶液濃度的變化如圖6所示。

圖6 不同NaOH濃度時剛果紅試劑與8種純化多糖最大吸收波長變化情況Fig.6 Changes in maximum absorption wavelength of mixture of Congo red and eight kinds of purified polysaccharides at different concentration of NaOH

由圖6可知，隨著NaOH濃度增大，LXZ-1與剛果紅形成的絡合物的最大吸收波長沒有明顯變化。DZT、GZT、XG與剛果紅形成的絡合物均發生一定程度的紅移，當NaOH濃度為0.3 mol/L時最大吸收波長最大，隨濃度的繼續增加吸收呈現下降趨勢。而FL、FC、LXZ-2、LXZ-3隨NaOH濃度的增加吸收發生急劇下降，說明DZT、GZT、LXZ-1、XG這4種純化多糖在水溶液中不具有三股螺旋結構構象，推測這些多糖中的糖苷鍵具有很高的柔順性，從而使得多糖分子整體不具剛性，導致它們不能形成螺旋結構和多股螺旋鏈構象，在水溶液中呈無規線團鏈構象。FC、LXZ-2、LXZ-3、FL這4種純化多糖具有三股螺旋結構構象，說明其有很高的剛性，在水溶液里有較規則有序的構象。

2.2.7 多糖抗氧化能力的測定

8種多糖的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和還原能力測定結果見圖7。

圖7 8種多糖抗氧化能力測定Fig.7 Determination of the antioxidant capacity of eight kinds of purified polysaccharides

由圖 7（a）可知，當樣品濃度為 5 mg/mL 時，FC、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2 和 LXZ-3 多 糖對DPPH自由基清除率分別為42.66%、97.06%、23.10%、29.95%、46.54%、20.26%、31.63%、21.06%。由圖 7（b）可知，在多糖的濃度是 2.5 mg/mL 時，FC、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2 和 LXZ-3 多糖對 ABTS+自由基清除率分別為26.03%、99.53%、17.05%、49.59%、51.69%、16.43%、31.26%、35.18%；在 0.5 mg/mL～2.5 mg/mL范圍內，隨著濃度的增加，XG對ABTS+自由基的清除率逐漸增強，且其對ABTS+自由基清除能力逐漸接近VC，其余7種多糖對ABTS+自由基的清除率明顯低于XG。由圖 7（c）可以看出，FC、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2和LXZ-3多糖均具有一定的還原能力。相比VC來說，8種純化多糖的還原力明顯低于同濃度VC的還原力。8種多糖中，香菇多糖對DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和還原能力明顯高于其他7種多糖。

2.3 多糖構效關系分析

采用偏最小二乘回歸（partial least-squares regression，PLS）模型對8種純化多糖的理化性質、結構特征與多糖生物活性之間的構效關系進行統計學分析。其中分子量、特性黏度、多糖的單糖組成（葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖）為X矩陣，多糖對DPPH和ABTS+自由基的清除率和多糖的還原力為Y矩陣，結果如圖8所示。

圖8 發菜多糖抗氧化活性的PLS分析Fig.8 PLS of antioxidant activity of polysaccharides

多糖構效關系的PLS模型擬合性與預測性較好（R2Xcum=0.935，R2Ycum=0.852，Q2cum=0.842）。圖 8（a）為8種多糖組分構效關系的PLS得分圖，第一主成分的累計貢獻率在95%以上。圖8（b）為8種多糖組分構效關系的PLS載荷圖，從載荷圖可以看出，葡萄糖醛酸這個點距離原點最遠，結果表明對多糖抗氧化活性貢獻最大的單糖為葡萄糖醛酸。圖8（c）為PLS模型下的VIP分析。通過VIP結果分析可以看出，VIP＞0.5的變量由大到小依次為葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖和分子量。說明對多糖體外抗氧化生物活性影響較大的結構特征為：單糖組成（葡萄糖醛酸、半乳糖和葡萄糖）和分子量。已有研究報道，分子量高的多糖，生物活性往往較高[20]。酸性多糖中糖醛酸含量與抗氧化活性呈正相關，糖醛酸含量越高，抗氧化活性越強[21]，這與本試驗結果相吻合。

3 結論

本研究通過對發菜、地木耳、葛仙米、螺旋藻、香菇和茯苓進行多糖的提取和分離純化，得到8種純化多糖。通過測定其特性黏度和分子量，結果表明，多糖溶液的特性黏度與分子量大小有關。采用GC-MS對8種純化多糖的單糖組成進行了分析，結果表明，8種多糖都含有半乳糖和葡萄糖。由紅外光譜分析可知，香菇多糖、茯苓多糖、發菜多糖分子以β-糖苷鍵連接為主。剛果紅試驗結果顯示，地木耳多糖、葛仙米多糖、螺旋藻-1多糖、香菇多糖這4種純化多糖在水溶液中不具有三股螺旋結構構象，發菜多糖、螺旋藻-2多糖、螺旋藻-3多糖、茯苓多糖這4種純化多糖具有三股螺旋結構構象。體外抗氧化能力結果表明，在試驗濃度范圍內，發菜多糖、香菇多糖、茯苓多糖、葛仙米多糖、地木耳多糖、螺旋藻多糖-1、螺旋藻多糖-2、螺旋藻多糖-3對DPPH自由基的清除率最高分別可達到42.66%、97.06%、48.27%、29.95%、46.54%、21.43%、31.63%和52.75%，對ABTS+自由基清除率最高分別為26.03%、99.53%、17.05%、49.59%、51.69%、16.43%、31.26%、35.18%。其中香菇多糖對DPPH自由基的清除作用、ABTS+自由基的清除能力和還原能力最強。PLS模型對8種純化多糖的理化性質、結構特征與多糖生物活性之間的構效關系進行統計學分析，結果表明，單糖組成（葡萄糖醛酸、半乳糖和葡萄糖）和分子量對多糖體外抗氧化生物活性影響較大。本研究為藻類多糖和真菌多糖的具體結構和抗氧化活性的進一步研究和開發利用提供參考依據。