紅毛藻復合脫腥工藝的優化及其揮發性成分GC-MS分析

徐玉雪，陳艷紅，2，3，陳昭華，杜希萍，2，3*，姜澤東，2，3，倪輝，2，3，李清彪，2，3

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

紅毛藻（Bangia fusco-purpurea），又稱紅毛菜、紅發菜，屬紅藻門，是一種可食用的珍貴海洋紅藻，含有豐富的脂肪、蛋白質和各類氨基酸，具有提高免疫力、降血壓、降血脂和防止動脈粥狀硬化等心血管疾病的食、藥用功效[1-3]。近年來，隨著人民生活水平的提高，紅毛藻的養殖及加工受到了越來越多的關注，其中福建省莆田市紅毛藻被認定為國家地理標志產品[4]。但由于紅毛藻具有強烈的腥味，影響食品風味及其在終端產品中的應用。而目前尚缺少有效的紅毛藻脫腥技術，限制了其深加工產品的開發。

相關研究報道可以采用物理法、化學法、生物法和復合法對食品進行脫腥[5]。其中，物理脫腥法中的加熱脫腥是利用高溫使異味物質揮發，從而達到脫腥效果[6]?；瘜W脫腥法中采用溶劑浸泡可以去除腥味，其中有機酸可以消除組胺、螯合金屬離子，有助于減少腥味物質的產生[7]，常用脫腥的可食用酸有醋酸、檸檬酸、蘋果酸等。然而，單一脫腥技術都有其適用范圍和局限性，而采用兩種或兩種以上脫腥技術，利用各方法之間的互補和協同增效作用，可達到更好的脫腥效果。因此，通常會采用多種方法的對比和聯合使用，以確定最佳的工藝。尹宗美等發現復配藍莓酵素-薄荷提取物脫腥劑對裙帶梗的脫腥效果最佳，將藍莓酵素與薄荷提取物復配（30∶1的質量比），脫腥劑溶液的固形物含量2%，最佳脫腥條件為脫腥劑溶液與裙帶梗的質量比12∶1，脫腥時間3 h，脫腥溫度30℃[8]。張淼等用CaCl2和綠茶質量比為1∶1的復合脫腥劑對銀鱈魚進行脫腥，結果表明復合脫腥劑濃度2.75%、浸泡料液比 1∶11（g/mL），浸泡時間 48 min、浸泡溫度 38.3 ℃時，銀鱈魚脫腥效果最優[9]。不同的食品由于原料特性及腥味成分的差異，脫腥的工藝并不完全相同。

分析檢測腥味的方法主要有感官評價及儀器分析兩種方法。其中，感官檢驗是借助人的嗅覺器官感知腥味的強度[10]，是最直接的宏觀評價方法。儀器分析方法中，頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 具有操作時間短、分離能力高、鑒定準確度高等優點[11]。

本文以國家地理標志產品福建莆田紅毛藻為研究對象，采用復合法加熱聯合浸泡脫腥劑對紅毛藻脫腥，應用正交試驗優化脫腥工藝，并使用感官評價結合GC-MS檢測分析脫腥前后紅毛藻揮發性成分的變化，為紅毛藻產品加工和延伸制品的推廣提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅毛藻：福建省莆田市南日島；檸檬酸、冰醋酸、無水碳酸鈉、乙醇：國藥集團上海化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

QP-2010 Plus氣相色譜質譜串聯儀、Rtx-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱：日本島津公司；BC/BD-318A冰箱：青島海爾特種冰柜有限公司；BS233S電子天平：德國賽多利斯科學儀器廠；ZXRD-85110定溫恒溫干燥箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 材料的處理

將紅毛藻置于15倍～20倍體積的清水中，浸泡1 h后，清水洗至紅毛藻表面無泥沙等雜質，撈出瀝干后放置于烘箱，40℃烘干備用。

1.4 復合法脫腥工藝的單因素優化

1.4.1 加熱溫度的優化

將紅毛藻放置在不同溫度（30、50、70、90、110 ℃）的烘箱處理1 h，分別稱取加熱處理后紅毛藻0.1 g，加入30 mL蒸餾水，60℃水浴30 min，以紅毛藻腥味強度為指標，進行感官評分，研究加熱溫度對紅毛藻脫腥效果的影響，每組樣品處理設3次平行。

1.4.2 加熱時間的優化

在最優加熱溫度的條件下，將紅毛藻放置于烘箱分別處理 1、2、3、4、5 h，稱取加熱處理后紅毛藻 0.1 g，分別加入30 mL蒸餾水，60℃水浴30 min，以紅毛藻腥味強度為指標，進行感官評價，研究加熱時間對紅毛藻脫腥效果的影響，每組樣品處理設3次平行。

1.4.3 浸泡脫腥劑種類的優化

參考相關脫腥文獻[12-13]，選取5%檸檬酸溶液、5%乙醇溶液、5%碳酸鈉溶液和5%醋酸溶液為浸泡脫腥劑。將紅毛藻置于燒杯中，分別加入等量的水和不同浸泡脫腥劑，處理30 min，洗凈烘干；分別稱取浸泡處理后的紅毛藻0.1 g，加入30 mL蒸餾水，60℃水浴30 min，以紅毛藻腥味強度為指標，進行感官評價，研究浸泡脫腥劑種類對紅毛藻脫腥效果的影響，每組樣品處理設3次平行。

1.4.4 浸泡脫腥劑濃度的優化

在最優加熱溫度、加熱時間及浸泡脫腥劑的條件下，將紅毛藻分別置于等量、濃度為1%、3%、5%、7%、9%的浸泡脫腥劑中，處理30 min，洗凈烘干；分別稱取浸泡處理后的紅毛藻0.1 g，加入30 mL蒸餾水，60℃水浴30 min，以紅毛藻腥味強度為指標，進行感官評價，研究浸泡脫腥劑濃度對紅毛藻脫腥效果的影響，每組樣品處理設3次平行。

1.4.5 浸泡脫腥劑處理時間的優化

在最優加熱溫度、加熱時間及浸泡脫腥劑的條件下，將紅毛藻置于最優濃度的浸泡脫腥劑，分別處理0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，洗凈烘干；分別稱取浸泡處理后的紅毛藻0.1 g，加入30 mL蒸餾水，60℃水浴30 min，以紅毛藻腥味強度為指標，進行感官評價，研究浸泡脫腥劑處理時間對紅毛藻脫腥效果的影響，每組樣品處理設3次平行。

1.5 復合脫腥正交試驗優化

在單因素試驗結果的基礎上，選取加熱溫度（A）、加熱時間（B）、醋酸濃度（C）和處理時間（D）4個因素，采用四因素三水平的正交試驗分析方法，以紅毛藻復合脫腥感官評分結果為指標，優選出紅毛藻復合脫腥的最優工藝參數，正交試驗的因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal experimental design

1.6 分析方法

1.6.1 紅毛藻腥味強度的評價

根據文獻[14-15]并稍作修改，召集10名（5男5女，23歲～30歲）具有食品感官評定經驗的人員組成評定小組。評分標準為：基本無腥味，1分～3分；腥味一般，4分～6分；腥味重，7分～9分；腥味很重難以接受，10分。評定結果以10名評價員打分的平均值表示。

1.6.2 紅毛藻揮發性成分分析

樣品制備：取30 mL超純水于50 mL萃取瓶中，加入1 g復合脫腥后的紅毛藻，再加入10 μL 1 mg/mL的環己酮作為內標物，擰緊瓶蓋，搖勻，置于60℃恒溫水浴鍋中平衡30 min。采用老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取頭吸附30 min，進行GC-MS分析。每組樣品處理設3次平行。未經復合脫腥紅毛藻作為空白對照，處理同上。

色譜條件為色譜柱：Rtx-5MS石英毛細柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：進樣口溫度為 230℃；最初溫度為50℃并保持5min，以3℃/min升溫至200℃，在200℃保持1 min。用高純氦氣（純度99.999%）作為載氣，柱流量為3 mL/min，不分流進樣。

質譜條件：電子轟擊（electron impact，EI）離子源；電子能量70eV；離子源溫度200℃；接口溫度為250℃；掃描方式選擇SCAN模式進行定性分析；質量掃描范圍m/z 35～500。溶劑延遲時間為3 min。

定性定量分析：運用質譜數據庫（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）進行相似度檢索，根據不同物質的基峰、質荷比和相對峰度做串連檢索與人工解析，質譜匹配度大于80%作為物質鑒定標準；計算待測組分的保留指數，與文獻報道的保留指數進行對比定性。

式中：RIx為待測定成分的保留指數；t（i）為待測成分的調整保留時間，min；t（n）為具有n個碳原子數的正構烷烴的調整保留時間，min；t（n+1）為具有n+1個碳原子數的正構烷烴的調整保留時間，min。

此外，采用內標法進行定量，按公式（2）進行計算。

1.7 數據統計分析

通過Microsoft Office Excel 2010軟件與SPSS軟件計算試驗數據的均值和標準差并進行顯著性分析（Duncan檢驗，p＜0.05），并繪柱狀圖。通過正交試驗設計（orthogonal experimental design）軟件進行正交試驗的設計及結果分析。

2 結果與分析

2.1 加熱溫度對紅毛藻脫腥效果的影響

加熱溫度對紅毛藻脫腥效果的影響見圖1。

圖1 加熱溫度對紅毛藻脫腥效果的影響Fig.1 Effect of heating temperature on the fishy odor of B.fuscopurpurea

如圖1所示，在30℃～90℃范圍內，隨著溫度升高腥味感官評分逐漸降低，并存在顯著性差異；90℃～110℃范圍內，隨著溫度升高腥味感官評分稍有下降但無顯著性差異，原因可能是加熱溫度超過一定界限繼續升高時，紅毛藻中揮發性氣體成分的濃度及種類開始增大，減弱了溫度對紅毛藻腥味的影響。王琳等[16]研究表明，隨著加熱溫度增加，螺旋藻腥味越來越淡，當溫度大于60℃時，脫腥變化趨于平穩，本試驗結果與其具有相似性。此外，由于溫度高于70℃時，紅毛藻的顏色逐漸變淺，表明紅毛藻色素可能被破壞，因此選擇70℃為紅毛藻最佳脫腥溫度。

2.2 加熱時間對紅毛藻脫腥效果的影響

加熱時間對紅毛藻脫腥效果的影響見圖2。

圖2 加熱時間對紅毛藻脫腥效果的影響Fig.2 Effect of heating time on the fishy odor of B.fusco-purpurea

由圖2可知，在加熱時間1 h～4 h范圍內，隨著時間延長，腥味感官評分從8分降到5分，并存在顯著性差異；4 h～5 h范圍內，隨著時間增加腥味感官評分稍有下降但無顯著性差異。陽暉等[17]利用加熱法對螺旋藻脫腥，發現加熱時間變化對脫腥效果影響較小，隨著時間延長其顏色會發生變化。而本研究結果表明加熱時間對紅毛藻腥味具有一定的影響，綜合考慮脫腥效果和節省時間，選擇4 h為最佳加熱時間。

2.3 浸泡脫腥劑對紅毛藻脫腥效果的影響

浸泡脫腥劑對紅毛藻脫腥效果的影響見圖3。

圖3 浸泡脫腥劑對紅毛藻脫腥效果的影響Fig.3 Effect of soaking deodorant on the fishy odor of B.fuscopurpurea

從圖3可以看出，通過浸泡脫腥劑處理紅毛藻后，各種脫腥劑對紅毛藻有顯著脫腥效果，其中乙醇與醋酸脫腥效果最好。俞靜芬等[12]用5%檸檬酸和5%醋酸分別處理海帶60 min，醋酸脫腥效果優于檸檬酸。江潔等[13]研究發現酸法和乙醇脫腥效果相當，堿法效果最差。本研究結果與以上學者研究的脫腥規律具有相似性。此外，由于乙醇和碳酸鈉處理會引起紅毛藻顏色發生變化，因此選擇醋酸為最優的浸泡脫腥劑。

2.4 醋酸濃度對紅毛藻脫腥效果的影響

醋酸濃度對紅毛藻脫腥效果的影響見圖4。

圖4 醋酸濃度對紅毛藻脫腥效果的影響Fig.4 Effect of acetic acid concentration on the fishy odor of B.fusco-purpurea

由圖4可知，在1%～9%濃度的范圍內，隨醋酸濃度的增加，紅毛藻腥味逐漸降低；其中3%與5%濃度的醋酸處理紅毛藻，其感官評分無顯著性差異；7%與9%濃度的醋酸處理紅毛藻，其感官評分無顯著性差異。由于隨著醋酸濃度增加，其酸味逐漸增強，故選擇3%為最佳醋酸濃度。

2.5 醋酸處理時間對紅毛藻脫腥效果的影響

醋酸處理時間對紅毛藻脫腥效果的影響見圖5。

圖5 醋酸處理時間對紅毛藻脫腥效果的影響Fig.5 Effect of acetic acid treatment time on the fishy odor of B.fusco-purpurea

如圖5所示，隨著醋酸處理時間的增加，其感官評分逐漸降低，其中處理時間為2.0 h～2.5 h時，感官評分雖有降低但無顯著性差異，從節省時間考慮，選擇2.0 h為最優處理時間。

2.6 紅毛藻復合脫腥正交試驗優化

運用正交試驗法研究紅毛藻復合脫腥的最優工藝，試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experimental results

由表2可以看出，各因素對提取率影響大小次序為：D＞A＞B＞C，即醋酸處理時間＞加熱溫度＞加熱時間＞醋酸濃度。根據k值最優組合為A3B3C1D2和A3B2C1D2，即加熱溫度90℃，加熱時間4 h（或3h），醋酸濃度3%，醋酸處理時間2.0h，正交試驗最優組合為A2B3C1D2，此時感官評分最低為1.5，由于加熱后紅毛藻的顏色變淺，表明紅毛藻色素被破壞，故不選擇加熱溫度90℃。故選擇A2B3C1D2為最優脫腥工藝。

2.7 紅毛藻復合脫腥前后揮發性成分的對比

選擇最優脫腥工藝處理的樣品和未處理樣品進行紅毛藻脫腥前后揮發性成分的對比，紅毛藻復合脫腥前后揮發性物質的總離子流結果如圖6所示。

圖6 復合脫腥紅毛藻前后總離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram（TIC）of the volatiles in the B.fusco-purpurea before and after compound deodorization

未經復合脫腥紅毛藻樣品中共鑒定出7大類46種揮發性成分，其中醇類4種，烯烴7種，醛類12種，酮類13種，酯類2種，烷烴類3種和其它類5種；復合脫腥紅毛藻樣品中共鑒定出6大類26種揮發性成分，其中醛類8種，酮類2種，烷烴類7種，烯烴類2種，酯類1種，其它類6種。相關研究報道，烷烴類化合物的氣味閾值較高，對藻類腥味貢獻不大；醛類、醇類化合物氣味閾值一般較低，通常會產生一些令人不愉快、辛辣的刺激性氣味，其中庚醛、2，4-庚二烯醛、2-辛烯醛、2，4-辛二烯醛、2，4-癸二烯醛、壬醛、2-壬烯醛、2，4-辛二烯、1-辛烯-3-醇、3，5-辛二烯-2-酮等是腥味的主要貢獻者[18-22]。部分化合物由于含量少，無法確定其化學結構，部分為色譜柱成分流失產生的雜峰，將這些成分扣除后，依據相似度檢索、特征離子碎片分析以及參照相關文獻，對揮發性成分進行定性定量，結果如表3所示。

表3 紅毛藻復合脫腥揮發性成分定性定量表Table 3 Identification and content of the volatiles of the B.fusco-purpurea compound deodorization

續表3 紅毛藻復合脫腥揮發性成分定性定量表Continue table 3 Identification and content of the volatiles of the B.fusco-purpurea compound deodorization

由表3可知，紅毛藻空白對照樣品的揮發性成分中，醇類主要有 1-辛烯-3-醇（88.38 μg/g）、2-癸烯-1-醇（55.81 μg/g），醛類主要有壬醛（44.40 μg/g）、癸醛（2.81 μg/g）、2-壬烯醛 （0.96 μg/g）、2，4-癸二烯醛（0.23 μg/g），酮類主要有 3，5-辛二烯-2-酮（2.53 μg/g）。其中揮發性成分1-辛烯-3-醇、壬醛、2-壬烯醛、2，4-癸二烯醛和3，5-辛二烯-2-酮為文獻[18-22]報道的腥味成分，是造成紅毛藻腥味主要物質。

紅毛藻經過復合脫腥后，其揮發性成分由46種變為26種，醇類、醛類和酮類物質明顯減少，烷烴類和其它類物質明顯增多，其中腥味成分1-辛烯-3-醇、2-壬烯醛、2，4-癸二烯醛、3，5-辛二烯-2-酮的含量降為 0，壬醛由44.40 μg/g降為37.89 μg/g，是造成紅毛藻腥味下降的主要原因。β-紫羅蘭酮由44.52 μg/g增為88.89 μg/g，β-環檸檬醛由 3.00 μg/g 增為 9.42 μg/g，其中α-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮主要呈木香和花香等，β-環檸檬醛主要呈薄荷香、果香等[23]，對脫腥后的紅毛藻氣味具有一定的貢獻。顧賽麒等[24]研究發現，海帶脫腥后醛類、酮類、醇類等揮發性成分有效降低，庚醛、辛醛和癸醛等直鏈醛的濃度發生了顯著下降，1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇脫除率分別為25.87%和100%，脫腥效果明顯。本研究發現復合脫腥后紅毛藻的主要腥味成分消失，與顧賽麒等研究結果一致。

3 結論

本文采用加熱聯用浸泡脫腥劑對紅毛藻脫腥，結果發現復合脫腥可顯著降低紅毛藻的腥味，最優脫腥工藝為加熱溫度70℃，加熱時間4 h，醋酸濃度3%，醋酸處理時間2.0 h。GC-MS分析紅毛藻脫腥前后揮發性成分，結果表明，脫腥前紅毛藻含有醇類、烯烴、醛類、酮類、酯類、烷烴類和其它類共7大類46種揮發性成分，其中 1-辛烯-3-醇、壬醛、2-壬烯醛、2，4-癸二烯醛和3，5-辛二烯-2-酮為腥味成分；復合脫腥后，揮發性成分由46種變為26種，醇類、醛類和酮類物質明顯減少，腥味成分 1-辛烯-3-醇、壬醛、2-壬烯醛、2，4-癸二烯醛和3，5-辛二烯-2-酮降為0，壬醛由44.40 μg/g降為37.89 μg/g。本研究結果為紅毛藻的精深加工提供了技術支持。