超聲-微波協同優化花生紅衣原花青素提取工藝及抗氧化研究

王娜，崔晨旭，鄭玉茹，解書蘊，師飛，張晗瑋，徐超*

（1.河南農業大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.鄭州市營養與健康食品重點實驗室，河南 鄭州 450002）

花生紅衣（peanut skin，PS），為豆科植物花生種皮，顏色通常為粉紅或紅色，味道苦澀[1]。花生紅衣作為花生深加工副產物，全球產量約93萬噸/年[2]，大多作為廢棄物，也有作為畜牧業的動物飼料，利用度和產品附加值低，造成資源的極大浪費和污染[3]?；ㄉt衣中含有豐富的活性成分，如單寧酸、白藜蘆醇，原花青素（procyanidins，PSPc）等[4]，特別是 PSPc 含量高達128 g/kg[3]，是一種普遍存在于植物中的多酚類物質。研究表明，PSPc 具有抗氧化[5]、抑菌[6]、抗癌[7-8]、降血脂、改善血糖水平[1]、抗過敏[9]以及抑制丙烯酰胺[10]產生的生物學功效，而且與葡萄籽原花青素相比，具有更高的生物利用度[11]。眾多研究顯示，PSPc可能成為未來膳食補充劑和功能成分的可持續來源[12]。

目前，花生紅衣中PSPc的提取方法主要包括：溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、超臨界提取法[3]。溶劑提取法提取時間長，且提取率普遍不高[13]；超臨界提取法相比于傳統輔助有機溶劑提取法得率更高、選擇性好，但成本高；微波輔助提取法和超聲輔助提取法具有縮短提取時間、降低提取劑用量、提高得率、綠色環保等優點[14-16]，溫志英[14]采用優化后的微波輔助提取法提取PSPc，PSPc提取率達到11.38%，王翠蓮等[17]優化后的PSPc超聲輔助提取法得率可達15.36%。但利用超聲-微波互作協同提取PSPc的方法未見報道。超聲-微波互作協同提取法，將超聲波輔助提取法和微波輔助提取法結合，具有提高效率，大大縮短提取時間、降低能耗等優點[18]，從而得到廣泛應用。

本研究以花生紅衣為原料，利用超聲-微波協同輔助乙醇提取PSPc，在單因素（超聲功率、超聲時間、微波功率、微波時間、乙醇濃度、料液比、浸提溫度）試驗的基礎上，利用Plackett-Burman（PB）試驗設計篩選出影響PSPc提取量的顯著因素，進一步采用響應面法對提取工藝進行優化；并且評價不同提取工藝對PSPc提取量和其抗氧化活性（DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和鐵離子還原/抗氧化能力），為花生紅衣的開發和高值利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生紅衣：河南農業大學食品科學技術學院鄭州市營養與健康食品重點實驗室提供；原花青素標準品（純度：95%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、AB-8大孔樹脂：美國Solarbio公司；甲醇、無水乙醇、石油醚（30℃～60℃）、水楊酸、過氧化氫、七水合硫酸亞鐵（均為分析純）：國藥集團化學試劑公司。

CW-2000型超聲-微波協同提取儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；UV-1100紫外分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器、SHZ-Ⅲ型循環水真空泵、C-0506低溫恒溫槽：上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10D真空冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠有限公司；HC-200T高速多功能粉碎機：武義海納電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生紅衣干粉制備

將花生紅衣干燥后粉碎過80目篩，用石油醚脫脂，然后抽濾、烘干，得到脫脂后的花生紅衣粉末裝自封袋備用。

1.2.2 PSPc制備工藝

工藝流程：花生紅衣干粉→抽提去脂→超聲-微波協同作用→水浴浸提→冷卻并抽濾→原花青素提取液→大孔樹脂凈化→真空濃縮→冷凍干燥→研磨粉碎。

1.2.3 PSPc提取量的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制

參考周婷等[19]的研究中標準曲線制作方法，以吸光度對原花青素濃度做標準曲線。

1.2.3.2 試樣測定

將樣品用甲醇稀釋后，吸取0.5mL試樣并加入3mL香草醛-甲醇溶液、1.5 mL濃鹽酸，然后迅速混勻（避光操作），30℃水浴20min，于500nm波長下測吸光度。

試樣中PSPc提取量計算公式如下。

式中：X為試樣中原花青素的提取量，mg/g；X1為通過標準曲線計算出的原花青素含量，mg/mL；V1為試樣定容體積，mL；f為稀釋倍數；m為樣品質量，g。

1.2.4 單因素試驗設計

準確稱量0.5 g花生紅衣干粉，提取工藝同1.2.2，研究超聲功率、超聲時間、微波功率、微波時間、料液比、浸提溫度、乙醇體積分數7個因素對PSPc提取量的影響，單因素梯度如表1所示。每個試驗重復3次，結果取平均值。

表1 單因素試驗設計Table 1 Single factor experimental design

1.2.5 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman試驗設計可以篩選出對響應值影響較大的因素[20]。本試驗以花生紅衣原花青素提取量為響應值，在單因素的基礎上，利用Plackett-Burman試驗設計篩選超聲功率（A）、超聲時間（B）、微波功率（C）、微波時間（D）、乙醇體積分數（E）、浸提溫度（F）、料液比（G）7個因素對PSPc提取量的影響，為進一步的Box-Behnken試驗奠定基礎。因素及水平見表2。

表2 Plackett-Burman試驗設計因素及水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman test design

1.2.6 響應面試驗設計

根據Plackett-Burman試驗的篩選結果，選擇對PSPc提取量影響最大的乙醇體積分數、微波功率、料液比3個因素作為自變量，以PSPc提取量為響應值（Y），根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，采用三因素三水平的響應面分析試驗，優化花生紅衣原花青素的提取工藝，試驗因素和水平設計見表3。

表3 試驗設計因素和水平Table 3 Experimental factors level

1.2.7 不同提取方法對PSPc的提取量和抗氧化活性的影響

為比較不同提取方法對PSPc提取量和抗氧化活性的影響，準確稱量0.5 g花生紅衣干粉4份，分別用水提法、乙醇提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法提取，提取工藝按1.2.2，4種不同提取法的提取條件參考超聲-微波協同提取的最優條件進行設定。水提法[4]：料液比 1∶75（g/mL）、提取時間 20 min、水浴溫度50℃；乙醇提取法[6]：乙醇體積分數55%、料液比為1∶37.5（g/mL）、提取時間 30 min、水浴溫度 60 ℃；微波輔助浸提法[14]：乙醇體積分數70%，料液比1∶40（g/mL），微波時間 120 s，微波功率 240 W；超聲輔助浸提法[5]：乙醇體積分數 70%、料液比為 1∶50（g/mL）、超聲功率153 W、超聲時間8 min、水浴溫度60℃、水浴時間50 min。

1.2.7.1 PSPc對DPPH自由基清除能力的影響

參考王翠蓮等[17]對DPPH自由基清除率的測定方法。按以下公式計算樣品對DPPH自由基的清除率。

式中：A1為樣品與DPPH混合液吸光度；A2為樣品與無水乙醇混合液吸光度；A0為DPPH與無水乙醇混合液吸光度。

1.2.7.2 PSPc對羥自由基清除能力的影響

參考王翠蓮等[17]對羥自由基清除能力的測定方法，按照以下公式計算樣品對羥自由基的清除率。

式中：Ai為樣品與FeSO4、水楊酸-乙醇溶液、過氧化氫溶液的混合液吸光度；Aj為樣品與FeSO4、水楊酸-乙醇溶液混合液吸光度；A0為FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液、過氧化氫溶液的吸光度。

1.2.7.3 PSPc對鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）值的影響

參考王翠蓮等[17]對FRAP值的測定方法。精密吸取樣品溶液 10 μL 和 200 μL 2，4，6-三吡啶基三嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ] 工作液到 96微孔板，充分混勻，37℃水浴鍋加熱反應40 min，于酶標儀測定吸光度，波長設置593 nm，根據標準曲線計算樣品的FRAP值。

1.3 數據處理

采用Excel 2010對單因素試驗數據進行處理并作圖，使用SPSS單因素ANOVA檢驗中的最小顯著差異（least significant difference，LSD）法和鄧肯法進行顯著性分析，顯著性水平p＜0.05。運用Design-Expert 8.0中的Plackett-Burman試驗設計和Box-Behnken中心試驗設計對試驗結果進行分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 原花青素的標準曲線

原花青素提取量與吸光度之間的標準曲線如圖1所示。原花青素濃度在0～20 μg/mL時，吸光度與原花青素濃度之間線性關系良好，線性方程為：y=16.65x+0.010 7（R2=0.999 1，n=3）。

圖1 原花青素的標準曲線Fig.1 Procyanidins standard curve

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲功率和超聲時間對PSPc提取量的影響

超聲功率和超聲時間對PSPc提取量的影響見圖2。

圖2 超聲功率和超聲時間對PSPc提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction content of PSPc

由圖2可知，PSPc提取量隨超聲功率呈先增大后減少的趨勢，在160 W時提取量最高為168.95 mg/g，并顯著高于其它功率時的提取量。超聲功率的增大可使花生紅衣細胞破碎程度增加，有利于PSPc的溶出，使提取量逐漸增高；而隨著功率繼續增大，超聲熱效應積累的熱量增多，使原花青素遇熱氧化和降解，導致提取量降低[21]。由圖2可知，隨著超聲時間延長，PSPc提取量顯著增加，在10 min時為最高值174.95 mg/g，隨后呈顯著減少趨勢。這是因為隨超聲時間繼續延長，樣品中原花青素已基本溶出，但過度超聲處理會導致PSPc結構發生改變，并有其他干擾物質溶出，導致提取量降低。因此，本試驗認為超聲功率選擇160 W，超聲時間選擇10 min，較為合適。

2.2.2 微波功率和微波時間對PSPc提取量的影響

微波功率和微波時間對PSPc提取量的影響見圖3。

圖3 微波功率和微波時間對PSPc提取量的影響Fig.3 Effect of microwave power and microwave time on the extraction content of PSPc

微波具有破壞細胞組織，加速組織內物質溶出的作用[14]。由圖3可知微波功率為240 W時，提取量達最大為157.54 mg/g，之后隨著功率的增大，PSPc提取量快速下降。這是因為微波功率過大，會破壞原花青素的穩定性，導致提取量的降低。在微波處理90 s時，提取液中原花青素含量最大為164.75 mg/g，隨后呈下降趨勢，當微波時間超過120 s后，呈顯著下降趨勢。這是由于一定體積溶液中PSPc的溶解度是一定的，伴隨微波作用對花生紅衣組織的不斷破壞，使得PSPc溶解加快，開始PSPc溶解含量逐漸增加，當原花青素的溶解量已經達到最大后，繼續延長時間，反而會引起溶液局部溫度升高，破壞了PSPc的結構，使提取量下降[22-23]。因此，本試驗中微波功率選擇240 W，微波時間選擇90 s，較為合適。

2.2.3 浸提溫度、乙醇體積分數和料液比對PSPc提取量的影響

浸提溫度、乙醇體積分數和料液比對PSPc提取量的影響如圖4所示。

圖4 浸提溫度、乙醇體積分數和料液比對PSPc提取量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature,ethanol volume fraction and material/liquid ratio on the extraction content of PSPc

由圖4可知，當浸提溫度為50℃時，PSPc提取量達到最大201.06 mg/g，然后隨溫度的升高，PSPc的提取量逐漸下降。溫度的升高可增大溶劑分子的布朗運動，使得溶劑與PSPc相互接觸更快更充分，所以浸提溫度達到50℃后繼續升高浸提溫度，高溫會破壞PSPc結構，導致PSPc提取量下降[18]。PSPc的提取量隨著乙醇體積分數的增加而增加，當乙醇體積分數為70%時，PSPc提取量最高達201.32 mg/g，之后繼續增大乙醇體積分數，PSPc提取量反而下降。因為不同體積分數的乙醇溶液極性不同，而PSPc具有一定極性，所以導致PSPc對不同體積分數的乙醇溶液有不同的選擇性與溶解性。當料液比為1∶40（g/mL），PSPc的提取量最大。這是由于提取溶劑的增加可以溶解更多的PSPc，被提取的量也就越多；當PSPc的溶解速率達到平衡點之后，繼續增加提取溶劑反而降低了提取效率，還增加提取成本，給后續的純化工作造成不必要的麻煩。因此，本試驗選擇浸提溫度50℃、乙醇體積分數 70%、料液比 1∶40（g/mL）。

2.3 Plackett-Burman試驗結果

通過Plackett-Burman試驗設計對影響PSPc提取效果的因素進行顯著性分析，試驗設計及結果見表4，試驗結果方差分析見表5。

表4 Plackett-Burman試驗方案和結果Table 4 Experimental design and results of Plackett-Burman design

表5 Plackett-Burman模型方差分析Table 5 Analysis of variance of Plackett-Burman design

由表5 PB試驗結果方差分析可知，該試驗模型極顯著（p＜0.01）。結合單因素試驗與PB試驗結果可知，微波功率（C）、乙醇體積分數（E）、料液比（G）對PSPc提取量影響顯著 （p＜0.05），顯著性大小排序為料液比（G）＞微波功率（C）＞乙醇體積分數（E），所以選擇微波功率（C）、乙醇體積分數（E）和料液比（G）進行響應面的優化設計試驗；而超聲功率（A）、超聲時間（B）、微波時間（D）、浸提溫度（F）4個因素對原花青素提取量影響不顯著（p＞0.05），所以在后續試驗中將其固定為160 W、10 min、90 s、50℃。

2.4 響應面試驗設計及結果

響應面試驗設計及結果見表6。

表6 響應面試驗設計及結果Table 6 Response surface test design and results

利用Design-Expert 8.0對表6中的數據進行方差分析和回歸分析，對試驗結果進行擬合。以乙醇體積分數（E）、微波功率（C）和料液比（G）為自變量，擬合得到回歸方程：PSPc提取量=184.20-7.67E+0.883 8C+7.47G-1.33EC+4.41EG-1.41CG-5.85E2-12.62C2+2.35G2。

回歸方程的方差分析見表7。

表7 回歸方程的方差分析Table 7 Analysis of variance of regression model

由表7可看出，整個回歸模型極顯著（p＜0.000 1），相關決定系數R2=0.976 5，校正系數R2Adj=0.946 4，失擬項檢驗不顯著（p=0.603 4＞0.05），說明該模型的擬合性較好，且真實有效，能夠較好地反映3個變量之間的關系。乙醇體積分數和料液比對提取量有極顯著影響（p＜0.01）。乙醇體積分數（E）與料液比（G）有顯著交互作用（p＜0.05）。

2.4.1 響應面交互作用分析

交互作用對PSPc提取量影響的響應面圖見圖5。

圖5 交互作用對PSPc提取量影響的響應面圖Fig.5 Response surface of the effect of interaction terms on extraction amount of PSPc

響應面3D曲面圖反映兩兩因素之間對響應值的影響作用，其中3D曲面圖越陡峭，說明兩因素之間交互作用越明顯[24]。從圖5可以看出乙醇體積分數和料液比之間交互作用顯著（p＜0.05），其余兩兩因素之間交互作用不顯著（p＞0.05）。該結果與方差分析結果一致。

2.4.2 最優提取工藝參數及驗證

通過利用Design-Expert 8.0設計分析得到的超聲-微波協同提取原花青素最佳工藝為提取方案為乙醇體積分數68.75%、微波功率241.17 W、料液比1∶39（g/mL），預測 PSPc提取量為 189.59 mg/g。結合實際操作，修正為：乙醇體積分數70%、微波功率240 W、料液比 1∶40（g/mL）。此時 PSPc提取量為 186.38 mg/g，相對標準偏差為1.7%，說明模型有效。

2.5 不同提取方法對PSPc提取量及其抗氧化性的影響

不同提取方法對PSPc的提取效率和生物活性會產生不同的影響[25]，對提取產物中PSPc的提取量和抗氧化性進行了分析，結果如表8所示。

表8 提取方式對PSPc提取量和抗氧化性影響Table 8 The effect of extraction method on PSPc content and oxidation resistance

從表8可以看出，超聲波輔助提取法的PSPc提取量最低為90.46 mg/g，超聲-微波協同提取的效率最高，PSPc提取量高達186.38 mg/g，顯著高于微波輔助提取法、超聲波輔助提取法和溶劑提取法（p＜0.05）。

水浴提取的PSPc羥自由基清除率、DPPH自由基清除率和FRAP值，均顯著低于其它幾種提取方式（p＜0.05）；微波輔助提取PSPc的DPPH自由基清除率和FRAP值，均顯著高于其它幾種提取方式（p＜0.05）；超聲-微波協同提取PSPc的DPPH自由基清除率顯著高于超聲波水浴法，FRAP值顯著高于超聲波法、水浴法、超聲波水浴法和乙醇法。綜上表明，超聲-微波協同提取法在獲得PSPc最大提取量的同時，還具有較好的抗氧化活性。因此，超聲-微波協同提取PSPc是一種較好的提取方法，可以為PSPc的工業化應用提供一種新的提取思路。

3 結論

本研究綜合單因素試驗、Plackett-Burman試驗設計，篩選出對PSPc提取具有顯著影響的因素，在此基礎上用Box-Behnken試驗設計對超聲-微波協同提取PSPc的工藝進行優化研究，得出超聲-微波協同輔助乙醇提取PSPc的最佳工藝為：超聲功率160 W、超聲時間10 min、微波功率240 W、微波時間90 s、乙醇體積分數70%、浸提溫度50℃、浸提時間20 min、料液比1∶40（g/mL）。在此條件下，原花青素的提取量可達到186.38 mg/g，同時，優化后的超聲-微波協同提取量顯著高于其他方法（p＜0.05），且有較好的抗氧化活性。該研究可以為花生紅衣中提取原花青素提供一定的理論參考。