微型氫化物發(fā)生-原子熒光法測定水產(chǎn)品汞形態(tài)

程雪萌，羅明標*，席群麗，左麗華，李咸宇，王為民，楊梅，龔治湘

（1.東華理工大學江西省合成化學重點實驗室，江西 南昌 330013；2.譜焰實業(yè)（上海）有限公司，上海 200000）

汞是影響人類和生態(tài)系統(tǒng)健康的環(huán)境污染物之一[1]，所有汞都是有毒的，汞的毒性、生物利用度和流動性不僅取決于其總濃度，而且還取決于其化學形式[2]，形態(tài)不同，產(chǎn)生的毒性也不同，其中有機汞化合物通常比無機汞更具毒性[3]。蝦蟹等水產(chǎn)品處于水生食物鏈較高位置，經(jīng)食物鏈累積和生物放大作用，其體內(nèi)通常積累了高濃度的有機汞，并通過食物鏈富集到人體內(nèi)，對人體產(chǎn)生毒害作用[4-5]。因此，水產(chǎn)品中的形態(tài)分析具有非常重要的社會意義。汞形態(tài)分析最常見的方法是將一種強大的分離技術與一種靈敏的原子光譜檢測儀聯(lián)用，例如氣相色譜（gas chromatography，GC）、液相色譜（liquid chromatography，LC），或者是毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）與電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupled atomic emission spectroscopy，ICP-AES）、電感耦合等離子質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）、原子熒光光譜（atomic fluorescence spectroscopy，AFS）、原子吸收光譜（atomic absorption spectroscopy，AAS）等聯(lián)用[6-13]，盡管這些聯(lián)用技術強大，可以提供更多的信息，但是也存在一些缺點，大多儀器造價昂貴不適于普及，且均需要分離富集等復雜的預處理步驟[14-17]。而本試驗不需聯(lián)用技術，單用成本低廉、靈敏度高，基體干擾小的原子熒光光度計[18-19]即可實現(xiàn)汞形態(tài)的準確檢測。試驗利用汞不同形態(tài)的化學行為，以溴化劑作為有機汞的消解劑，以非色譜方法將有機汞轉化為無機汞，在有無溴化劑的條件下，檢測水產(chǎn)品中總汞和無機汞，利用差減法即可得出有機汞的含量。采用具有新型微型氫化物發(fā)生裝置的原子熒光光度計[20]，將氫化物發(fā)生控制在一個非常狹小的空間里，使氫化物可以在最短的時間和路徑內(nèi)被快速送入原子化器，可以有效地降低汞的記憶效應，使得原子熒光光度計在檢測有機汞的同時提高檢測的準確性。本文以溴化劑作為有機汞消解劑，微型氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法作為檢測方法，實現(xiàn)對水產(chǎn)品中汞形態(tài)準確檢測，該方法高效、簡便、價格低廉，為水產(chǎn)品中汞形態(tài)的測定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸（優(yōu)級純）、硝酸（優(yōu)級純）、溴酸鉀（分析純）、鹽酸羥胺（分析純）、硼氫化鈉（分析純）、高錳酸鉀（分析純）、過硫酸鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：西隴化工股份有限公司；溴化鉀（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；Hg標準儲備液（10 μg/L）、氯化甲基汞、氯化乙基汞標準溶液：Merck公司；水產(chǎn)品：市售。

1.2 儀器與設備

CAF-1800原子熒光光度計：譜焰實業(yè)（上海）有限公司；TG18-WS臺式高速離心機：長沙市維爾康湘鷹離心機有限公司；摩爾分析型超純水器制備：上海摩勒生物科技有限公司；0.45 μm濾膜：美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

稱取樣品 0.50 g～2.0 g（精確至 0.000 1 g），置于15 mL塑料離心管中，加入10 mL的鹽酸溶液（5 mol/L），25℃下超聲30 min并放置過夜。25℃超聲水浴提取60 min，期間振搖數(shù)次。4℃下以8 000 r/min轉速離心5 min。隨后吸取上清液，并用0.45 μm濾膜過濾，保存于4℃。

1.3.2 樣品中有機汞及無機汞的測定

取2.5 mL溶液置于離心管中，加入5 mL 50% HCl，定容至25 mL后，直接上機檢測，結果為無機汞含量。取2.5 mL溶液置于離心管中，加入5 mL 50% HCl，0.5 mL溴化劑（30 g/L溴化鉀+10 g/L溴酸鉀），塞上瓶蓋，放40 min，后滴加1滴～3滴鹽酸羥胺溶液（30 g/L），用力振搖100次，至溶液由黃色轉為無色，定容至25 mL，上機檢測總汞含量。有機汞的含量為兩者之差。同時做空白試驗。

1.3.3 有機汞對無機汞測定的影響

從 50 ng/mL Hg 標準溶液里分別取 0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于 25 mL 容量瓶中，各加入5 mL 50% HCl，用水稀釋至刻度搖勻備用，配制成系列濃度為 0、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ng/mL 的無機汞溶液。從25 ng/mL氯化甲基汞和氯化乙基汞混標溶液（其中氯化甲基汞溶液與氯化乙基汞溶液濃度相同）里分別取 0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于25 mL容量瓶中，各加入5 mL 50% HCl，用水稀釋至刻度搖勻備用，配制成系列濃度為 0、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ng/mL 的有機汞溶液。

1.3.4 溴化劑用量及消解時間方法建立

兩組樣品，第一組分別取樣品組織液2.5 mL置于若干個離心管中，加入5 mL 50% HCl，2.5 mL 10 ng/mL的氯化甲基汞乙基汞混標溶液，再分別加入0.3、0.5、1、2、3 mL溴化劑，塞上瓶蓋，在25℃下分別放置20、40、60、80、100、120 min，后滴加 1 滴～3 滴鹽酸羥胺溶液，用力振搖100次，至溶液由黃色轉為無色，定容至25 mL。第二組不加氯化甲基汞乙基汞混標溶液，其它條件同上，上機檢測并計算回收率。

1.3.5 標準溶液的配制

汞標準工作液：用10 μg/L Hg標準溶液（含5% HNO3）稀釋至 100 ng/mL（含 5% HNO3），臨用時將此溶液稀釋成5 ng/mL標準溶液（含2% HNO3）。分別取此溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于 25 mL 容量瓶中，各加入5 mL 50% HCl，用水稀釋至刻度搖勻備用，配制成系列濃度為 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ng/mL 的 Hg溶液。

1.3.6 參數(shù)優(yōu)化

配制0.5 ng/mL的Hg標準溶液，固定其它條件不變，分別改變NaBH4溶液在0.02%～0.50%之間，優(yōu)化出最佳NaBH4濃度；固定其它條件不變，分別改變鹽酸溶液濃度在5%～20%之間，優(yōu)化出最佳鹽酸濃度；固定其它條件不變，分別改變燈電流在5 mA～35 mA之間，優(yōu)化出最佳燈電流；固定其它條件不變，分別改變負高壓在200 V～250 V之間，優(yōu)化出最佳負高壓。

1.3.7 CAF-1800原子熒光光度計儀器工作條件

光電倍增管負高壓：220 V；燈電流：15 mA；原子化器高度：9 mm；載帶氣流量：500 mL/min；屏蔽氣流量：1 000 mL/min；延遲時間：0 s；讀數(shù)時間：10 s；進樣量：2 mL；測量方法：標準曲線法；讀數(shù)方式：峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

樣品分析均重復3次，結果以平均值±標準差的形式表示。采用數(shù)學圖形分析軟件Origin85繪圖，用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 有機汞對無機汞測定的影響

分別配制無機汞系列和有機汞系列，在不加溴化劑的情況下，上機測定無機汞和有機汞的熒光強度。有機汞對無機汞測定的影響見圖1。

圖1 有機汞對無機汞測定的影響Fig.1 The influence of reducing agent on the determination of organic mercury

圖1表明，無機汞能與NaBH4反應且呈現(xiàn)良好的線性關系，而有機汞只能與部分NaBH4反應[21]，5 ng/mL的有機汞產(chǎn)生的信號小于同濃度無機汞信號的3%。因此在實際樣品分析中，有機汞的存在不會影響到無機汞的測定，直接測出的是無機汞。將樣品氧化后，有機汞可以轉化成可測定的無機汞，實現(xiàn)無機汞和有機汞的測定。

2.2 有機汞氧化劑的選擇

將有機汞轉化為無機汞，常用的氧化劑有高錳酸鉀、過硫酸鈉、溴化劑等[22]。利用高錳酸鉀溶液（2%）、過硫酸鈉（2%）、溴化劑等氧化劑對1 ng/mL烷基汞標液進行氧化。表1為不同氧化劑及不同條件下對標液中有機汞的氧化結果。

表1 25℃下不同氧化劑的消解效果（n=6）Table 1 Digestion effect of different oxidants at room temperature（n=6）

由表1可知，過硫酸鈉在25℃下不能很好地將有機汞轉化成無機汞，通常通過加熱、微波或紫外線輔助處理，以提高有機汞的轉化率[23]。高錳酸鉀在25℃下可以很好地轉化有機汞，但其作為氧化劑時，容易在管路內(nèi)壁生成二氧化錳，既會造成管路堵塞又會對元素產(chǎn)生吸附[5]。溴化劑在25℃下就可以很好地將有機汞轉化成無機汞，且不會出現(xiàn)管路堵塞的情況。綜合考慮，選擇溴化劑作為氧化劑。

2.3 溴化劑用量及消解時間的選擇

有機汞是否能夠消解完全，溴化劑的用量以及消解時間是關鍵因素。取若干份相同的螃蟹組織樣品提取液，改變溴化劑的用量和消解時間對其進行氧化，結果見圖2。

圖2 溴化劑在不同用量和消解時間下對有機汞氧化結果的影響Fig.2 The effect of brominating agent on the results of organic mercury oxidation under different dosages and digestion times

由圖2可知，當溴化劑含量在0.5 mL，消解時間達到40 min時回收率最好，因此最終選擇溴化劑用量為0.5 mL，消解時間為40 min。

2.4 無機汞和有機汞的標準曲線

為了驗證溴化劑消解后的有機汞和無機汞溶液能否用同一條標準曲線進行測定，配制了加入相同溴化劑用量的有機汞標液、無機汞標液、有機汞與無機汞混標溶液等3個系列標準溶液,結果見圖3。

圖3 3種系列溶液標準曲線Fig.3 Standard working curves of three series of solutions

由圖3可知，3種標液的標準曲線的斜率很接近，線性關系良好，表明總汞和無機汞可以用同一條曲線進行測定，同時也可以進一步證明，溴化劑可以將有機汞完全氧化成無機汞。

2.5 參數(shù)優(yōu)化

2.5.1 還原劑溶液濃度的優(yōu)化

硼氫化鈉的濃度會影響到Hg的熒光強度，濃度太低會導致汞的熒光信號變?nèi)酰瑵舛忍邥r反應產(chǎn)生的氫氣過多會稀釋汞蒸氣，使得靈敏度下降，精度變差。因此探究了不同NaBH4濃度下Hg的熒光強度，結果見圖4。

圖4 不同NaBH4濃度下Hg的熒光強度Fig.4 Fluorescence intensity of Hg under different NaBH4 concentrations

通過試驗結果綜合判斷，NaBH4溶液的濃度在0.2%時作為還原劑的效果最好。

2.5.2 鹽酸溶液濃度的優(yōu)化

鹽酸的濃度會影響氫氣的生成，進而會使熒光強度受到影響。在優(yōu)選鹽酸溶液濃度的過程中，不同鹽酸濃度對Hg熒光強度的影響見圖5。

圖5 不同鹽酸濃度下Hg的熒光強度Fig.5 Fluorescence intensity of Hg under different HCl concentration

通過試驗結果綜合判斷，鹽酸溶液的濃度在10%時的效果最好。

2.5.3 燈電流的優(yōu)化

增加燈電流，會使汞的熒光強度增加，并且可以改善低濃度處的線性。但是燈電流過大會產(chǎn)生自吸現(xiàn)象，縮短高強度汞空心陰極燈的壽命。在優(yōu)選燈電流的過程中，不同燈電流對Hg熒光強度的影響見圖6。

圖6 燈電流對汞熒光強度的影響Fig.6 Effect of lamp current on mercury fluorescence intensity

由圖6可以發(fā)現(xiàn)，汞的熒光強度隨著燈電流的增大而不斷增大，但是較大的燈電流會減少高強度空心陰極燈的壽命，因此，通過試驗結果綜合判斷，燈電流在15 mA時已經(jīng)可以滿足正常測定需求。

2.5.4 負高壓的優(yōu)化

負高壓增加，會使噪聲加大，同時信號也會增加。在優(yōu)選負高壓的過程中，不同負高壓對Hg熒光強度的影響見圖7。

圖7 負高壓對汞熒光強度的影響Fig.7 Influence of negative high pressure on mercury fluorescence intensity

通過試驗結果綜合判斷，負高壓在220 V時已經(jīng)可以滿足正常測定需求。

2.6 精密度與檢出限

配制質(zhì)量濃度為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ng/mL 的無機汞標液，按照試驗方法在儀器最佳條件下考察其線性范圍，在0～1 ng/mL范圍內(nèi)，無機汞標液回歸方程為y=2416.9x+5.3，相關系數(shù)r=0.999 7。按照試驗方法測得本法的檢出限為（n=11）0.014 0 ng/mL，對螃蟹組織樣品連續(xù)測定7次，求得相對標準偏差為4.2%。

2.7 回收率

加標回收測定結果見表2。

表2 加標回收測定結果（n=6）Table 2 Test results of spiked recovery（n=6）

在螃蟹體肉組織和花甲體肉組織的提取液中加入不同量的有機汞標準溶液，放置大約30 min，隨后按照樣品分析步驟進行分析測定。得到了各樣品的加標回收率在86%～101%之間，相對標準偏差在1.5%～6.2%之間。

2.8 樣品分析

采用建立的方法隨機對市售不同水產(chǎn)品的各個部位的無機汞和總汞進行檢測，結果見表3。

表3 螃蟹中有機汞和無機汞的含量結果（n=3）Table 3 Results of the content of organic and inorganic mercury in crabs（n=3）

通過對實際樣品的分析，發(fā)現(xiàn)在螃蟹樣品中汞主要以有機汞形式存在，其中蟹足肉、螃蟹體肉、花甲肉、蝦肉的有機汞含量相對較高，所有水產(chǎn)品中各個部位的含量均未超過GB 2762—2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》中水產(chǎn)生物及其制品中甲基汞的限量（0.5 mg/kg）。

3 結論

本文對微型氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法檢測水產(chǎn)品中汞形態(tài)的幾個影響因素進行了優(yōu)化和討論，并在最優(yōu)的條件下對蝦、蟹、花甲等各個部位進行了測定，驗證了該方法的有效性。試驗結果表明，以溴化劑作為氧化劑，建立的微型氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定水產(chǎn)品中有機汞的方法是準確可行的。它具有簡單、無色譜、低成本和高靈敏度的特點?；诓煌螒B(tài)不同化學的非色譜方法為汞形態(tài)分析開辟了另一條途徑。適用于水產(chǎn)品中有機汞的準確測定。