外源鐵培養(yǎng)液對玉米發(fā)芽過程中營養(yǎng)成分和抗氧化活性的影響

顏亮亮，胡廣林

（海南大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，海南 海口 570228）

玉米是禾本科玉蜀黍?qū)僦参铮缓瑢θ梭w健康有益的活性成分，如蛋白質(zhì)、脂肪、維生素以及微量元素等。隱性饑餓（hidden hunger）是指機(jī)體營養(yǎng)不平衡或者缺乏某種維生素及人體必需的礦物質(zhì)。鐵缺乏位居全球三大“隱性饑餓”之首，影響到世界上20%～50%的人群[1]。2歲以內(nèi)嬰幼兒、60歲以上老人、育齡婦女是貧血患病的高危人群[2]。鐵缺乏或貧血可對人體健康產(chǎn)生多種危害，包括兒童生長發(fā)育遲緩、工人勞動效率下降、機(jī)體免疫力降低等[3]。人體鐵的主要膳食來源為主食農(nóng)作物，而主食中鐵含量低，且含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子影響鐵的吸收利用，從而導(dǎo)致膳食攝入可利用鐵不足[4]。通過植物育種或轉(zhuǎn)基因技術(shù)對作物生物強(qiáng)化從而改善鐵營養(yǎng)狀況的良好效果已得到了證明[5]。近年來通過培養(yǎng)液培育萌發(fā)谷物及豆類種子提高其營養(yǎng)價值成為新的預(yù)防隱性饑餓的方式，余賽西等[6]使用鐵、鋅培養(yǎng)液強(qiáng)化萌發(fā)大豆，發(fā)現(xiàn)鐵、鋅培養(yǎng)液能夠提高發(fā)芽大豆中微量元素鐵、鋅和鐵蛋白的含量，有效地提高了發(fā)芽大豆中鐵、鋅元素含量。李圓圓等[7]利用鋅、錳、銅、亞鐵培養(yǎng)液萌發(fā)黑豆發(fā)現(xiàn)能夠提高黑豆中微量元素和營養(yǎng)素含量，并且能夠降低植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，提高了黑豆微量元素的生物可利用性，從而提高了黑豆?fàn)I養(yǎng)價值。盡管有關(guān)通過含有微量元素的培養(yǎng)液生物強(qiáng)化種子萌發(fā)的研究越來越多，但是關(guān)于玉米生物強(qiáng)化的相關(guān)研究較少，使用不同形態(tài)的鐵培養(yǎng)液強(qiáng)化萌發(fā)玉米，探究玉米芽苗營養(yǎng)特性變化的研究還尚未見報道。

本試驗使用超純水對玉米種子浸種，對兩種不同的外源鐵強(qiáng)化劑進(jìn)行生物強(qiáng)化萌發(fā)，研究不同鐵強(qiáng)化劑對玉米微量元素和營養(yǎng)物質(zhì)的影響，為富鐵玉米芽苗菜成為人體補(bǔ)鐵的膳食營養(yǎng)來源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金海13號：萊州市金海種業(yè)有限公司；鹽酸（優(yōu)級純）、七水合硫酸亞鐵（分析純）、過氧化氫（優(yōu)級純）、正丁醇（分析純）、硝酸（優(yōu)級純）、亞硝酸鈉（分析純）、草酸（分析純）：西隴化工股份有限公司；乙二胺四乙酸鐵鈉[（ethylenediaminetetraacetic acid ferric sodium salt，F(xiàn)eⅢ-EDTA），分析純]、三羥甲基氨基甲烷、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、2，4，6-三吡啶基三嗪、蘆丁（分析對照品）：上海麥克林生化科技有限公司；Zn標(biāo)準(zhǔn)溶液、Fe標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL）：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；次氯酸鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：廣州光華科技股份有限公司；硝酸鋁（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵銨（分析純）、碳酸氫鈉（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；原花青素（分析對照品）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004N 電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；101B數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱：上海滬越實(shí)驗儀器有限公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器：國華企業(yè)公司；單道可調(diào)式手動移液器[eppendorf（0～1 000 μL）、Finnpipette（1 mL～5 mL）]；TAS-99 火焰原子吸收分光光度計、TU-1901紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；HSR025型人工氣候箱：南京實(shí)驗儀器廠；DL-5-B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；JL-180DTH超聲波清洗儀：上海杰理科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 兩種鐵培養(yǎng)液的配制

準(zhǔn)確稱取0.124 4 g七水合硫酸亞鐵于燒杯中，加水溶解后轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中，用水定容至刻度線得硫酸亞鐵濃度為100 μg/mL的培養(yǎng)液。隨后依次稀釋成 5、10、20、50、100 μg/mL 的培養(yǎng)液；準(zhǔn)確稱取0.164 3 g乙二胺四乙酸鐵鈉于燒杯中，加水溶解后轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中，用水定容至刻度線得FeⅢ-EDTA濃度為100 μg/mL的培養(yǎng)液。并依次稀釋得到 5、10、20、50、100 μg/mL 的培養(yǎng)液。

1.3.2 玉米芽苗的制備

玉米種子的選取和萌發(fā)前處理參考Zou等[8]的方法稍有改動，使用清水沖洗表面后用3%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，消毒結(jié)束后用蒸餾水沖洗種子表面3次～5次。玉米種子萌發(fā)條件參考GB/T 3543.4—1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗》[9]，將消毒后的玉米種子在人工氣候箱內(nèi)，使用超純水避光浸泡10 h，浸泡完畢后將玉米種子轉(zhuǎn)移到敞口塑料盒中，培養(yǎng)盒底部帶有排水孔和一層定性濾紙，并在種子上面覆蓋一層濾紙，隨后將培養(yǎng)盒置于（28±1）℃人工氣候箱中避光培養(yǎng)96 h，每4 h用不同濃度的兩種鐵培養(yǎng)液（硫酸亞鐵和FeⅢ-EDTA：5、10、20、50、100 μg/mL）分別噴灑，使玉米種子保持在濕潤環(huán)境中萌發(fā)。同時設(shè)置玉米未萌發(fā)種子為空白組，超純水萌發(fā)玉米為對照組。將強(qiáng)化萌發(fā)后的玉米樣品可食部分和不可食部分分開，將可食部分置于60℃恒溫干燥箱中干燥24 h后用研缽研磨成粉，過30目（0.600 mm）標(biāo)準(zhǔn)篩，裝入樣品袋-4℃冷藏保存。

1.3.3 鐵、鋅元素的分析測定

取0.5 g樣品裝入消化罐，加入5 mL濃硝酸過夜進(jìn)行預(yù)消化（或預(yù)消化4 h），預(yù)消化完成后加入1.5 mL雙氧水，將消化罐組裝密封后于160℃下恒溫消化5 h，消化結(jié)束后用5%硝酸定容到50 mL容量瓶，采用火焰原子分光光度法測定鐵、鋅含量。

1.3.4 玉米芽苗中總黃酮含量的測定

總黃酮的提取參考耿敬章[10]的方法，并有所改動，稱取1.0 g樣品于具塞試管中，加入15 mL 60%乙醇溶液，50℃恒溫水浴提取2 h后將提取液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶并用60%乙醇溶液定容，隨后總黃酮含量采用氯化鋁-亞硝酸鈉比色法[11]測定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用分光光度法測定其含量，總黃酮含量以mg/kgDW表示。

1.3.5 玉米芽苗中原花青素含量的測定

原花青素含量測定參考黃愛妮等[12]的方法，并有所改動，稱取玉米芽苗粉末0.5 g，用10 mL 50%乙醇溶液溶解，并超聲處理約20 min后于3 000 r/min離心20 min，離心后取上清液，重復(fù)1次后合并上清液用50%乙醇溶液定容到25mL。然后于10mL具塞試管中分別加入6 mL正丁醇-鹽酸溶液、1 mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）和樣品溶液、2 mL 硫酸鐵銨溶液（用2 mol/L鹽酸配成2%的溶液），混勻，同步做空白試驗。將所有試管置于沸水中精確反應(yīng)40 min后，立即放在冰水中15 min。在546 nm處，用甲醇調(diào)零，測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和樣品的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液中原花青素濃度，計算含量。

1.3.6 玉米芽苗的總抗氧化能力測定

總抗氧化能力測定參考Benzie等[13]方法，稍有改動。配制濃度為 0、22、44、66、88、110 μg/mL 的 VC標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0.3 mL的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣液，加入9 mL 2，4，6-三吡啶基三嗪（tri-2-pyridyl-s-triazine，TPTZ）工作液，0.6 mL超純水，在37℃下反應(yīng)30 min后，在593 nm處測量吸光度。TPTZ工作液由pH3.6的0.3 mmol/L醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L的TPTZ溶液和20 mmol/L的FeCl3溶液以10∶1∶1的體積比配制而成。樣品的總抗氧化能力以μg VC/g DW表示。

1.3.7 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除率測定參考Islam等[14]的方法，略微改動，準(zhǔn)確稱取0.019 7 g DPPH試劑，甲醇溶解定容至250 mL，得到2×10-4mol/L的DPPH溶液，吸取2 mL甲醇提取物加入2 mL DPPH溶液搖勻，在黑暗中反應(yīng)10 min，然后在525 nm處測定其吸光度。用下列方程計算其清除活性。

式中：A為DPPH甲醇溶液的吸光度；B為DPPH甲醇提取物（樣品）的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

為了確保試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，所有試驗重復(fù)進(jìn)行3次，利用SPSS 26.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Duncan進(jìn)行顯著性差異分析（P=0.05），所有圖形采用Origin 9.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵強(qiáng)化玉米芽苗中Fe、Zn含量

2.1.1 鐵強(qiáng)化玉米芽苗中Fe含量

鐵強(qiáng)化玉米芽苗中Fe含量見圖1。

圖1 鐵強(qiáng)化玉米芽苗中Fe含量Fig.1 The content of Fe in iron-enriched corn sprout

由圖1可以發(fā)現(xiàn)未發(fā)芽玉米種子中Fe含量約為45.22mg/kgDW，經(jīng)過發(fā)芽處理后玉米芽苗中Fe含量與未發(fā)芽種子相比有略微的上升，達(dá)到了55.18mg/kgDW。有研究[15]證明萌發(fā)有利于谷物、豆類對微量元素的吸收并促進(jìn)其營養(yǎng)價值提升，胡廣林等[16]研究也表明使用碘培養(yǎng)液強(qiáng)化萌發(fā)玉米能夠促進(jìn)玉米對碘元素的富集。玉米種子經(jīng)過鐵培養(yǎng)液培育過后的玉米芽苗中Fe含量都有顯著提升。當(dāng)培養(yǎng)液為硫酸亞鐵，在濃度為100 μg/mL時，F(xiàn)e含量達(dá)到最高497.97 mg/kg DW，相比對照組增加了902.45%。培養(yǎng)液為FeⅢ-EDTA時最高含量也是在濃度為100μg/mL，F(xiàn)e含量達(dá)到了最高，為249.32 mg/kg DW，相比對照組增加了451.83%。但是當(dāng)培養(yǎng)液為硫酸亞鐵，濃度為5 μg/mL時，玉米芽苗中的Fe含量有所下降，可能原因是由于低濃度的鐵培養(yǎng)液促進(jìn)種子萌發(fā)，并合成了相關(guān)酶，導(dǎo)致Fe有所流失。總體來說，硫酸亞鐵培養(yǎng)液對玉米芽苗中Fe元素的富集效果比FeⅢ-EDTA強(qiáng)，但是在低濃度（小于50 μg/mL）時，F(xiàn)eⅢ-EDTA的促進(jìn)效果比硫酸亞鐵更好，Sida-Arreola等[17-18]研究表明螯合形態(tài)的鐵比離子形態(tài)鐵更容易在豆類谷物種子中富集，且螯合鐵相比離子鐵更容易提高谷物豆類的生物產(chǎn)量。

2.1.2 鐵強(qiáng)化玉米芽苗中Zn含量

鐵強(qiáng)化玉米芽苗中Zn含量見圖2。

圖2 鐵強(qiáng)化玉米芽苗中Zn含量Fig.2 The content of Zn in iron-enriched corn sprout

由圖2可知，未發(fā)芽玉米中Zn含量約為17.76 mg/kg DW，玉米經(jīng)過發(fā)芽處理后Zn的含量有所提升，達(dá)到了22.09 mg/kg DW。發(fā)芽可以使植物中部分微量元素含量提高，但是經(jīng)過外源硫酸亞鐵培養(yǎng)液培育過后的玉米芽苗中Zn含量相比未發(fā)芽種子有略微上升，濃度為5 μg/mL時有略微下降，但相比對照組都略微下降，浮動約在79.58%～98.78%，可能是由于隨著外源鐵濃度的增高，種子中微量元素鋅的吸收受到了一定的抑制作用。經(jīng)過FeⅢ-EDTA培養(yǎng)液培育過后的玉米芽苗中Zn含量與硫酸亞鐵類似，相比未發(fā)芽種子有提升，相比對照組有所下降（除濃度20 μg/mL外），浮動約在85.20%～108.19%。但在濃度為20 μg/mL時，玉米芽苗相比對照組的Zn含量有略微提升。

2.2 鐵強(qiáng)化玉米芽苗中營養(yǎng)成分含量變化

2.2.1 總黃酮含量變化

鐵強(qiáng)化玉米芽苗中總黃酮含量見圖3。

圖3 鐵強(qiáng)化玉米芽苗中總黃酮含量Fig.3 The content of total flavonoids in iron-enriched corn sprout

由圖3中可以看出，未發(fā)芽的玉米種子中總黃酮含量為841.56 mg/kg DW，經(jīng)過蒸餾水發(fā)芽處理后總黃酮含量提高到了1 100.00 mg/kg DW，提高了大約130.71%。通過兩種不同培養(yǎng)液強(qiáng)化培育后總黃酮含量均有了一定提升，在培養(yǎng)液為FeⅢ-EDTA，濃度為5 μg/mL時含量最高可達(dá)到2 163.83 mg/kg DW。相比未發(fā)芽種子總黃酮含量提高了257.12%，相比對照組提高了196.71%。另外，通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，使用FeⅢ-EDTA培養(yǎng)液強(qiáng)化對玉米芽苗中總黃酮含量的提升大于使用硫酸亞鐵培養(yǎng)液對玉米芽苗中總黃酮含量的影響，說明使用FeⅢ-EDTA培養(yǎng)液更有利于黃酮類物質(zhì)在玉米芽苗體內(nèi)的合成。

2.2.2 原花青素含量變化

鐵強(qiáng)化玉米芽苗中原花青素含量見圖4。

圖4 鐵強(qiáng)化玉米芽苗中原花青素含量Fig.4 The content of anthocyanins in iron-enriched corn sprout

如圖4所示，未發(fā)芽的玉米種子中原花青素含量為213.23 mg/kg DW，這與Zhao等[19]得到的結(jié)果一致。Fe強(qiáng)化玉米芽苗中原花青素含量達(dá)到了216.54mg/kgDW～375.46 mg/kg DW。其中當(dāng)培養(yǎng)液為硫酸亞鐵時，經(jīng)過Fe強(qiáng)化過后的玉米芽苗中原花青素含量有明顯的提高，在濃度為20 μg/mL時達(dá)到最高，約為375.46mg/kgDW相比未發(fā)芽玉米種子提高了176.08%。當(dāng)培養(yǎng)液為FeⅢ-EDTA時，只有當(dāng)濃度為10μg/mL～20μg/mL時，原花青素含量相比未發(fā)芽種子有明顯提高，在濃度為10μg/mL時最高達(dá)到321.04 mg/kg，相比未發(fā)芽種子提高了150.56%。另外，經(jīng)過Fe強(qiáng)化過后的玉米芽苗中原花青素含量有明顯變化，且培養(yǎng)液為硫酸亞鐵時強(qiáng)化效果比FeⅢ-EDTA更好，說明使用硫酸亞鐵為培養(yǎng)液時更有利于玉米芽苗體內(nèi)合成原花青素。

2.3 抗氧化活性評價

2.3.1 總抗氧化能力測試

鐵強(qiáng)化玉米芽苗中總抗氧化能力見圖5。

圖5 鐵強(qiáng)化玉米芽苗中總抗氧化能力Fig.5 The total antioxidant capacity of iron-enriched corn sprout

由圖5可以看出，未發(fā)芽玉米的總抗氧化能力約為44.49μgVC/gDW，對照組則達(dá)到了82.43μgVC/gDW。當(dāng)培養(yǎng)液為硫酸亞鐵時，在濃度為50 μg/mL～100 μg/mL時，總抗氧化能力提升較為明顯，在50 μg/mL達(dá)到最大，約為102.90 μg VC/g DW。當(dāng)培養(yǎng)液為FeⅢ-EDTA時，在濃度為 5 μg/mL～20 μg/mL 以及 100 μg/mL 時提升最為明顯，在濃度為10μg/mL時最高達(dá)到119.89μgVC/g DW。另外，F(xiàn)eⅢ-EDTA對玉米芽苗的總抗氧化能力的影響要大于硫酸亞鐵對玉米芽苗總抗氧化能力的影響。

2.3.2 DPPH自由基清除能力測試

鐵強(qiáng)化玉米芽苗中DPPH自由基清除率見圖6。

圖6 鐵強(qiáng)化玉米芽苗中DPPH自由基清除率Fig.6 The DPPH free radical scavenging rate in iron-enriched corn sprout

如圖6所示，鐵強(qiáng)化玉米芽苗的DPPH自由基清除率均高于未發(fā)芽玉米，除培養(yǎng)液為FeⅢ-EDTA且濃度為20 μg/mL和50 μg/mL時，其他相比未發(fā)芽玉米均存在顯著性差異（P＜0.05），所有經(jīng)過培養(yǎng)液強(qiáng)化的玉米芽苗相比對照組均無顯著性差異（P＞0.05），DPPH自由基清除率整體呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的規(guī)律，Li等[20]研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過鐵培養(yǎng)液強(qiáng)化萌發(fā)過的發(fā)芽糙米DPPH自由基清除率也呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的規(guī)律。當(dāng)培養(yǎng)液為FeⅢ-EDTA，濃度為10 μg/mL時，DPPH自由基清除率最高達(dá)到87.63%，相比未發(fā)芽提高了123.60%。培養(yǎng)液為硫酸亞鐵時DPPH自由基清除率最高達(dá)到了87.59%，此時濃度為50 μg/mL，相比未發(fā)芽提高了123.54%。但是培養(yǎng)液為硫酸亞鐵對玉米芽苗DPPH自由基清除率的影響大于培養(yǎng)液為FeⅢ-EDTA時的影響。

3 結(jié)論

本研究表明，兩種鐵強(qiáng)化劑強(qiáng)化玉米萌發(fā)都能夠提高玉米芽苗中Fe含量，且不會使玉米芽苗中Zn含量明顯變化，另外玉米芽苗中總黃酮含量、原花青素含量都有所提高，通過對玉米芽苗的總抗氧化能力以及DPPH自由基清除率的測定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過鐵強(qiáng)化萌發(fā)后的玉米芽苗抗氧化能力和DPPH自由基清除率相比對照組都有所提升。說明使用Fe強(qiáng)化劑培育萌發(fā)玉米種子能夠提升玉米芽苗的營養(yǎng)品質(zhì)，所以使用外源鐵培養(yǎng)液培育的富鐵玉米芽苗菜在人體補(bǔ)鐵及其他營養(yǎng)健康領(lǐng)域中具有應(yīng)用價值。