伊伐布雷定通過調控TIMP-1表達對冠心病大鼠抗心肌纖維化和心肌保護作用的機制*

白延平 陳俊民 劉智娜

(延安大學附屬醫院 1.心內科；2.麻醉科，陜西 延安 716000)

心血管疾病是全球范圍內引發死亡和殘疾的主要原因，冠心病(Coronary Heart Disease)為心血管疾病之一，嚴重危害人類健康，其導致的死亡約占心血管疾病的一半[1]。冠心病的主要特征是動脈粥樣硬化，可能致使血管腔狹窄或發生阻塞，從而導致缺血性心臟疾病的發生，如心絞痛和心肌梗塞[2-4]。伊伐布雷定(Ivabradine)是一種特殊的降低心率藥物，可選擇性地抑制竇房結細胞中的If電流，而不影響心肌收縮功能和血管以及房室、心室內的傳導功能[5]。研究表明，伊伐布雷定具有縮小梗死面積、改善心功能、減輕心室重塑和延緩心力衰竭等作用，并且可以減輕心肌細胞凋亡和心臟功能障礙，發揮多效的心臟保護作用[6-7]。然而其在冠心病心肌纖維化過程中的作用與分子機制的相關研究報道卻相對較少。本研究通過構建冠心病大鼠模型，探討伊伐布雷定對冠心病大鼠抗心肌纖維化及心肌損傷的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級，雄性SD大鼠60只，鼠齡7～8周，體重180～220 g，購自延安大學醫學院實驗動物中心。本研究經延安大學附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 伊伐布雷定(法國Servier公司)；維生素 D3注射液(江蘇吳中醫藥集團有限公司)；胎牛血清(美國 Gibco公司)；超氧化物歧化酶試劑盒和總丙二醛劑盒(南京建成生物工程研究所)；腦鈉肽檢測試劑盒(上海百沃科技有限公司)；蘇木精-伊紅染色試劑(上海藍季科技發展有限公司)；Masson 染色試劑盒(北京世洛合力試劑公司)；抗體TIMP-1、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、Cleaved-Caspase3、Bcl-2、Bax(北京中杉金橋生物有限公司)；抗體GAPDH和HRP標記山羊抗兔IgG(美國Abcam公司)；免疫組化染色試劑(上海古朵生物科技有限公司)；RIPA 裂解緩沖液、BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組、造模及給藥 將SD大鼠適應性喂養1 周，按照隨機數字表法將60只大鼠隨機分為4組，包括對照組、模型組和伊伐布雷定低、高劑量組，每組15只。對照組大鼠給予基礎飼料(配方：玉米73.5%、麥麩20%、魚粉5%、谷粉1%、食鹽0.5%)喂養。其他3組大鼠參照文獻[8]方法構建冠心病大鼠模型：大鼠每日給予高脂食物(配方：基礎飼料78.8%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%、蛋黃粉10%、豬油10%)連續喂養，腹腔注射維生素D3 (0.7 mL/kg)，連續注射 3 d。12 周后，檢測大鼠心電圖，T 波抬高則表示冠心病模型建立成功。造模成功后，參考文獻給藥劑量[9]，伊伐布雷定低、高劑量組大鼠分別按照10 mg/kg、20 mg/kg的伊伐布雷定灌胃給藥，對照組和模型組大鼠同時給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續給藥4 周后進行后續實驗。

1.3.2 超聲成像系統檢測心功能指標 末次給藥后第2 d，使用 20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，采用小動物超聲成像Vevo2100系統(Visual Sonics公司)檢測大鼠的超聲心動圖，測定指標包括射血分數(Ejection Fraction，EF)、左心室縮短分數(Fraction Shortening，FS)、左心室舒張期內徑(Left Ventricular End-Diastolic Dimension，LVDD)和左心室收縮期內徑(Left Ventricular Internal Dimension Systole，LVDS)。

1.3.3 酶聯免疫吸附測定 心功能檢測結束后，打開大鼠腹腔，腹主動脈采集血液，在4 ℃低速離心機中以 4000 r/min 離心 5 min，取上層血清，用酶聯免疫分析儀測定丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)和腦鈉肽(BNP)水平，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 HE 染色 將大鼠主動脈弓和心肌組織用4%多聚甲醛進行固定，修剪包埋，浸于梯度乙醇進行脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，制成4 μm 的石蠟組織切片，蘇木精染色 5 min，流水沖洗后，伊紅染色液染色3 min，無水乙醇脫水，二甲苯中透明，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察并采集圖片，觀察斑塊橫截面和心肌組織的病理特征。

1.3.5 Masson 染色 將心肌組織石蠟切片脫蠟至水，用weigert氏蘇木溶液染處理10 min，1%鹽酸乙醇分化1 min，蒸餾水沖洗25 min，麗春紅酸性品紅液染色10 min，l%磷鉬酸水溶液分化5 min，2%亮綠染液染5 min，1%冰醋酸水溶液浸洗1 min。隨后分別用95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯中透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察心肌間質膠原纖維的表達情況，紅色為心肌組織，藍色為膠原纖維組織。

1.3.6 免疫組化染色 將心肌組織石蠟切片脫蠟至水，采用0.01 mol/L枸椽酸鹽緩沖液進行抗原修復，3% H2O2溶液去除內源性過氧化物酶，10%羊血清室溫封閉30 min，分別滴加一抗抗體TIMP-1(1∶100)、collagen Ⅰ(1∶200)和collagen Ⅲ(1∶200)，在4℃下孵育過夜。次日，PBS 沖洗，滴加對應的二抗抗體室溫孵育30 min。PBS 再次沖洗，滴加DAB 顯色，經復染、脫水、透明后，中性樹膠封片，在電子顯微鏡下觀察并進行圖像采集，免疫組化染色后陽性細胞呈棕色至棕褐色著色。

1.3.7 Western blot檢測 將心肌組織剪碎并加入RIPA 裂解緩沖液進行裂解，提取組織總蛋白，BCA 法進行蛋白濃度測定，電泳。10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，切膠并轉移至PVDF膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗抗體TIMP-1(1∶1000)、Cleaved-Caspase3(1∶1000)、Bcl-2(1∶500)和Bax(1∶500)，以GAPDH(1∶5000)抗體為內參，在4℃下孵育過夜。次日，TBST 漂洗 PVDF膜，將PVDF膜與HRP 標記的二抗常溫孵育 1 h，TBST 洗膜后，滴 ECL 發光液進行曝光，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質灰度值。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 造模12周后，對照組大鼠表現出規則的竇性心律，見圖1。與對照組比較，模型組大鼠的心電圖中觀察到不規則的竇性心律，ST段明顯升高，說明造模成功。在藥物治療后，各組大鼠超聲心動圖檢測結果，見圖2A。與對照組比較，模型組大鼠EF、FS均顯著下降，LVDD和LVSD顯著增加(P<0.05)；經過高、低劑量伊伐布雷定作用的大鼠，EF和FS較模型組顯著升高，LVDD和LVSD較模型組顯著減小(P<0.05)，見圖2B。

圖1 兩組大鼠心電圖檢測結果

圖2 超聲成像系統檢測各組大鼠心功能相關指標

2.2 各組大鼠血清MDA、SOD、BNP水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清MDA濃度顯著升高，SOD活性顯著降低，BNP水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，伊伐布雷定低劑量組和伊伐布雷定高劑量組大鼠血清MDA濃度顯著降低，SOD活性顯著升高，BNP水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清MDA、SOD、BNP水平比較

2.3 各組大鼠主動脈弓與心肌組織HE染色結果 對照組大鼠的血管內膜中沒有形成斑塊，而模型組斑塊面積較大，所占比例較高；伊伐布雷定低、高劑量組中斑塊面積比例較模型組顯著下降，見圖3。

圖3 HE染色檢測各組大鼠主動脈中的病理學變化(20×)

心肌組織HE染色結果顯示，對照組大鼠心肌纖維緊密、有序排列，心肌細胞大小均勻，無明顯炎癥細胞浸潤現象；模型組大鼠心肌纖維較大，排列紊亂，心肌細胞肥大、變性和壞死，出現大量炎性細胞的浸潤；伊伐布雷定低、高劑量組大鼠經伊伐布雷定給藥后，大鼠心肌纖維結構完整，心肌細胞排列較為規則，病變現象得到明顯的改善，見圖4。

圖4 HE染色檢測各組大鼠心肌組織病理學變化(200×)

2.4 各組大鼠心肌組織Masson染色結果 Masson染色結果顯示，對照組大鼠心肌細胞排列整齊，間質有少量的膠原纖維；模型組大鼠心肌細胞肥大、排列紊亂，數目減少，并出現大量的藍色膠原纖維；伊伐布雷定低、高劑量組大鼠心肌細胞較為完整，有較少的藍色膠原纖維，且高劑量組比低劑量組的膠原纖維化程度輕，見圖5。

圖5 Masson 染色檢測各組大鼠心肌組織膠原纖維化程度(200×)

2.5 各組大鼠心肌組織TIMP-1免疫組化染色結果 免疫組化染色檢測TIMP-1表達的結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織有大量棕褐色著色，TIMP-1陽性表達率顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，經過伊伐布雷定低、高劑量治療后，兩組大鼠心肌組織中棕褐色著色減少，TIMP-1陽性表達率顯著減少(P<0.05)，見圖6、表2。

圖6 免疫組化染色檢測各組大鼠心肌組織TIMP-1表達(100×)

2.6 各組大鼠心肌組織collagen Ⅰ和collagen Ⅲ免疫組化染色結果 免疫組化染色檢測collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表達結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織出現較深的棕褐色染色，collagen Ⅰ和collagen Ⅲ陽性表達率均顯著增加(P<0.05)；伊伐布雷定低、高劑量組大鼠心肌組織中染色變淺，collagen Ⅰ和collagen Ⅲ 陽性表達率較模型組顯著減少(P<0.05)，見圖7、表2。

圖7 免疫組化染色檢測各組大鼠心肌組織collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表達(200×)

表2 各組大鼠心肌組織TIMP-1、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ 陽性表達率

2.7 各組大鼠心肌組織TIMP-1、Cleaved-Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中TIMP-1蛋白相對表達量顯著升高，而經伊伐布雷定低、高劑量治療的兩組大鼠心肌組織中，TIMP-1蛋白相對表達量較模型組顯著降低(均P<0.05)；與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase3和Bax蛋白相對表達量顯著升高，而 Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，伊伐布雷定低、高劑量組心肌組織中Cleaved-Caspase3和Bax蛋白相對表達量顯著下降，Bcl-2蛋白相對表達量顯著增加(P<0.05)，見圖8。

圖8 Western blot檢測各組大鼠心肌組織TIMP-1、Cleaved-Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白表達

3 討論

冠心病作為典型的復雜疾病，發生、發展主要在于遺傳和環境因素的失調。高脂肪、高熱量、高血壓和高膽固醇以及糖尿病、吸煙、缺乏體育鍛煉、飲食不良以及精神緊張等都可能導致冠心病的發生[10-12]。伊伐布雷定作為一種抗心律失常的藥物，目前的研究已顯示，其治療后可降低因心臟癥狀而導致的死亡現象。Chen等[13]的研究發現，伊伐布雷定可明顯減輕糖尿病小鼠的心肌細胞凋亡和心臟功能障礙。Zuo等[14]的報道指出伊伐布雷定通過抑制JNK/p38 MAPK通路介導的炎癥和凋亡，從而發揮在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠心臟功能中的保護作用。本研究通過高脂飼料喂養聯合注射維生素 D3構建冠心病大鼠模型，通過檢測發現造模大鼠出現EF和FS下降、LVDD和LVSD增加的現象，并且心肌組織結構紊亂，心肌細胞肥大、變性及壞死，以上結果均說明冠心病大鼠模型構建成功，大鼠心肌組織受到了一定程度的損傷。而經過伊伐布雷定治療后，大鼠EF和FS升高，LVDD和LVSD減小，心肌組織損傷情況得到了明顯的改善。

心肌纖維化是指冠狀動脈長期狹窄后，導致的心肌缺血缺氧、心肌細胞肥大或萎縮，以及間質纖維增生的現象[15-17]。研究表明，心肌纖維化程度是預測不良心臟預后的重要指標。冠心病動脈粥樣硬化嚴重的心肌損傷過程是心肌纖維化和心肌細胞凋亡兩者結合的作用結果[18]。心肌細胞的凋亡會導致心肌收縮功能喪失，在冠心病進展中具有至關重要的作用，抗心肌細胞凋亡也是冠心病潛在的治療策略之一。已報道指出細胞凋亡會導致纖維化現象的發生[19]。因此誘導心肌再生、逆轉心肌組織纖維化和促進受損心臟功能恢復成為冠心病治療的重要目標。本研究結果顯示，經過伊伐布雷定治療的大鼠心肌組織纖維化程度明顯減小，同時，心肌組織內collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表達減少，促凋亡蛋白Cleaved-Caspase3和Bax的表達量下降，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達量增加，說明伊伐布雷定能夠抑制心肌組織纖維化和心肌細胞凋亡，從而起到心肌保護的作用。

TIMP-1作為基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)的抑制劑，由多種類型的細胞表達，并存在于大多人體組織和體液中[20-21]。MMP1和TIMP1之間的水平平衡控制著細胞周圍局部細胞外基質降解的程度，從而影響細胞的遷移、增殖和存活等過程[22]。此外，TIMP-1具有獨特的腫瘤刺激功能，如TIMP-1過表達可能通過VEGF促進腫瘤血管發生，促進浸潤轉移，乳腺癌中TIMP-1過表達和預后不良相關[23-25]。在本研究中，冠心病大鼠心肌組織中TIMP1出現異常高表達，經過伊伐布雷定治療后抑制了 TIMP1的表達，這可能是其作用機制之一。

4 結論

伊伐布雷定對冠心病大鼠的心臟保護作用可能與抑制心肌細胞凋亡，改善組織學異常和組織纖維化，抑制TIMP-1的異常高表達等相關。