水飛薊賓對(duì)硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用*

李燕菊 馮杰 韓忠誠(chéng) 趙婷 李紅健 馬俊鵬 孫力 瑪爾江·巴哈提別克 王燕 于魯海

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部, 新疆 烏魯木齊 830001；2.新疆維吾爾自治區(qū)臨床藥學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830001；3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，新疆 烏魯木齊 830001)

肝纖維化是肝臟長(zhǎng)期處于炎癥損傷狀態(tài)并進(jìn)展為肝硬化的一種病理生理過(guò)程，如不及時(shí)干預(yù)，可能會(huì)并發(fā)腹水、肝性腦病、肝腎綜合征等全身多組織器官病變，甚至?xí)M(jìn)展為肝癌等嚴(yán)重疾病[1-2]。水飛薊賓為從菊科植物水飛薊[Silybummarianum(L.) Gaertn.]中提取得到的一種天然產(chǎn)物，具有抗炎、抗病毒等作用[3]。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道[4]，水飛薊賓在肝纖維化的臨床治療中表現(xiàn)出顯著療效。本研究通過(guò)探討水飛薊賓對(duì)肝纖維化大鼠的作用及機(jī)制，旨在為水飛薊賓在肝纖維化治療中的藥理作用機(jī)制提供依據(jù)，并為水飛薊賓的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠45只，6～8周齡，體重180～200 g，購(gòu)買于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，動(dòng)物房溫度保持在20～24 ℃，濕度為40%～60%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合動(dòng)物試驗(yàn)倫理學(xué)要求。

1.2 藥品及試劑 水飛薊賓(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：IS0160，純度>98%)；硫代乙酰胺(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：T8700，純度>98%)；Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1340)；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒HA(上海信裕生物科技有限公司，貨號(hào)：CEA182Ge)、PCⅢ(上海雅吉生物科技有限公司，貨號(hào)：YS03777B)、LN (上海和序生物科技有限公司，貨號(hào)：EK0435)、ColⅣ酶ELISA檢測(cè)試劑盒(默瑞生物科技有限公司，貨號(hào)：KT-32025)；RIPA蛋白裂解液(貨號(hào)：P0013B)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào)：P0018M)、TGF-β1兔單克隆抗體(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號(hào)：LM-0086R)；Smad3、GAPDH兔單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (上海碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)：AF1501、AF1186、A0208)；蘇木素染液、伊紅染液(北京諾博萊德科技有限公司，批號(hào)：ZLI-9610、ZLI-9613)。

1.3 儀器及設(shè)備 Axio Imager M2M倒置顯微鏡(德國(guó)卡爾蔡司公司)；TG18-WS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘鑫儀器儀表有限公司)；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)；ChemiDoc XRS型凝膠成像儀(美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)有限公司)；S700半自動(dòng)石蠟切片機(jī)(瑞沃德生命科技有限公司)；DYCZ-24DN雙垂直電泳槽(山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司)；SD1-BS全自動(dòng)生化分析儀(成都斯馬特科技有限公司)。

1.4 肝纖維化大鼠模型的建立 45只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組及水飛薊賓組，每組15只。參照文獻(xiàn)方法[5-6]，除對(duì)照組外，其余大鼠按照200 mg/kg腹腔注射給予硫代乙酰胺，隔天1次，連續(xù)給予7周，對(duì)照組大鼠腹腔注射給予等量生理鹽水。造模結(jié)束后隨機(jī)抽取3只大鼠，麻醉后取肝組織，并采用HE染色法檢查肝組織病理學(xué)變化，以大鼠血清清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)水平顯著高于對(duì)照組，同時(shí)肝組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變視為造模成功。水飛薊賓組根據(jù)體重按照75.6 mg/kg的劑量灌胃給予大鼠水飛薊賓[7-8]，對(duì)照組及模型組灌胃給予等量生理鹽水，1次/d，給藥6周[8]。

1.5 各組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平檢測(cè) 大鼠末次給藥24 h后，眼眶后靜脈叢取血至離心管中，4℃靜置4 h，以4℃，3500 rpm離心10 min，取上清液，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平。

1.6 各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平檢測(cè) 腹腔注射給予10%水合氯醛(3 mL/kg)對(duì)大鼠麻醉后固定，取仰臥位，腹主動(dòng)脈取血至離心管，4℃靜置4 h，3500 rpm離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組大鼠血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)及Ⅳ型膠原蛋白(ColⅣ)水平。

1.7 各組大鼠肝組織病理學(xué)檢查 大鼠處死后分離肝組織， 10%中性甲醛中固定24 h，脫水、透明處理后，浸蠟、包埋、 5 μm切片，將石蠟切片依次經(jīng)過(guò)脫蠟、復(fù)水、蘇木精染色、分化、伊紅染色等步驟進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色)及Masson染色，在顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.8 Western blot檢測(cè)大鼠肝組織TGF-β1、Smad3水平 取各組大鼠肝組織，在玻璃勻漿器中加入RIPA蛋白裂解液進(jìn)行勻漿，以4 ℃，12000 rpm離心10 min，取上清液，加入上樣緩沖液，混勻后置于100 ℃水浴5 min變性。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取50μg蛋白進(jìn)行電泳分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉后，TGF-β1、Smad3及GAPDH抗體(1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶1000)室溫孵育1 h，PBST再次清洗3次，凝膠成像儀成像后，使用Image J 1.52v軟件進(jìn)行灰度值檢測(cè)及分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠ALT、AST、ALP及GGT水平 模型組肝纖維化大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平較對(duì)照組升高(P<0.05)；與模型組比較，水飛薊賓組血清ALT、AST、ALP、GGT水平降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平

2.2 大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平比較 模型組肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平較對(duì)照組升高(P<0.05)；與模型組比較，水飛薊賓組HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平

2.3 大鼠肝組織病理學(xué)檢查 對(duì)照組大鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝組織未見(jiàn)明顯病理學(xué)變化；與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織細(xì)胞排列不整齊，部分細(xì)胞壞死、脫落，存在膠原沉積，膽管增生，纖維組織增多，中心靜脈輕度擴(kuò)張充血，提示造模成功；與模型組比較，水飛薊賓組大鼠肝組織病理學(xué)變化出現(xiàn)不同程度的改善，水飛薊賓組大鼠肝組織細(xì)胞排列較整齊，中心靜脈充血減輕，纖維組織減少。各組大鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果，見(jiàn)圖1～2。

圖1 大鼠肝組織HE染色結(jié)果(200×)

2.4 大鼠肝組織TGF-β1、Smad3水平比較 模型組肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1、Smad3水平較對(duì)照組大鼠顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，水飛薊賓組TGF-β1、Smad3水平降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 大鼠肝組織Masson染色結(jié)果(200×)

圖3 大鼠肝組織TGF-β1及Smad3蛋白水平

3 討論

肝纖維化是由病毒性肝炎、自身免疫性疾病及藥物性原因引起的肝組織細(xì)胞損傷，且誘發(fā)因素長(zhǎng)期不能去除，導(dǎo)致肝組織細(xì)胞長(zhǎng)期處于炎癥狀態(tài)，進(jìn)而疾病進(jìn)展為肝纖維化。腹腔注射硫代乙酰胺是目前實(shí)驗(yàn)室常用的建立肝纖維化動(dòng)物模型的方法之一，并且具有方便、安全、造模成功率高等特點(diǎn)[9]。

水飛薊賓是從植物水飛薊的果實(shí)中提取得到的一種單體化合物，對(duì)肝炎、肝硬化等多種疾病具有一定的療效[10]。劉凱南等[11]研究表明，水飛薊賓聯(lián)合常規(guī)治療能夠改善酒精性肝病患者的肝功能，抑制患者體內(nèi)肝纖維化因子水平，且療效優(yōu)于常規(guī)治療。陳偉平[12]報(bào)道了水飛薊賓聯(lián)合抗病毒藥物替諾福韋能夠降低慢性乙型肝炎患者肝硬度，緩解肝纖維化進(jìn)展,這提示水飛薊賓在肝纖維化的治療中表現(xiàn)出巨大的潛力。

臨床中常使用ALT、AST、ALP、GGT等指標(biāo)評(píng)價(jià)肝功能，其水平的升高提示肝組織細(xì)胞受損及肝功能下降[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組肝纖維化大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平較對(duì)照組升高，提示造模成功，然而給予大鼠水飛薊賓及秋水仙堿后，血清ALT、AST、ALP、GGT水平較模型組降低。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)肝纖維化患者體內(nèi)HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平升高，提示HA、LN、PCⅢ、ColⅣ等因子均參與肝纖維化的過(guò)程[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓能夠顯著降低肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平，進(jìn)而緩解大鼠肝纖維化進(jìn)展。

TGF-β1通路是參與細(xì)胞增殖分化及細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡的重要信號(hào)通路[15-16]，Smad3是TGF-β1下游的重要信號(hào)基因[17]。TGF-β1的激活能夠活化Smad3蛋白，并能夠誘導(dǎo)和促進(jìn)表達(dá)TGF-β1及Smad3組織器官的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和纖維化，在肺、腎、肝等器官的纖維化過(guò)程中尤為重要[18]。李文庭等[19]研究表明，乙型肝炎病毒誘導(dǎo)肝纖維化的過(guò)程與激活TGF-β1信號(hào)通路的過(guò)程相關(guān)；郭輝等[20]研究表明，肝纖維化與TGF-β1/Smads信號(hào)通路的異常激活密切相關(guān)，抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)能夠緩解肝纖維化的進(jìn)展及預(yù)后。以上研究提示對(duì)于肝纖維化的治療，抑制TGF-β1/Smads通路及其相關(guān)蛋白的異常激活可能具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1、Smad3水平較模型組升高，給予大鼠水飛薊賓后，大鼠肝組織TGF-β1、Smad3水平均降低，提示水飛薊賓對(duì)肝纖維化大鼠的改善作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究證實(shí)，水飛薊賓對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1/Smads通路具有顯著的調(diào)節(jié)作用，為水飛薊賓在肝纖維化治療中的作用機(jī)制提出新的證據(jù)。但未能深入探討水飛薊賓對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1/Smad3通路的靶向調(diào)節(jié)作用，擬在今后研究中進(jìn)行深入探討。

4 結(jié)論

水飛薊賓能夠明顯改善硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝功能，抑制肝纖維化因子水平，改善大鼠肝組織病理學(xué)進(jìn)展，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路有關(guān)。