刺猬信號基因HHIP啟動子區甲基化與漢族老年骨質疏松癥的相關性*

卓婭·買買提烏斯滿 塔吉古麗·木沙 王紅梅

(新疆維吾爾自治區人民醫院干部保健二科，新疆 烏魯木齊 830002)

老年性骨質疏松癥(Senile Osteoporosis，SOP)是常見的骨質疏松癥(Osteoporosis,OP)類型[1]，因破骨細胞增加，骨吸收或/和成骨細胞減少骨形成導致不平衡的骨代謝-重建。刺猬(Hh)信號通路是一組調控胚胎形成、器官發生、成年干細胞穩態、組織維持并參與各種腫瘤的病因學信號；此信號中配體Hh與受體SMO結合減輕了PTCH1的抑制并上調了Gli1/2蛋白。另外，人類刺猬蛋白配體Hh可與HHIP蛋白相互作用，從而對Hh信號進行負調節[2]，與間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)的成骨分化密切相關[3-6]。DNA甲基化的研究已廣泛應用于包括OP在內的多種疾病中[7-9]。HHIP基因可參與軟骨內骨形成[10]。而HHIP的甲基化已被發現也可以在腫瘤中調節刺猬信號通路[11]。然而，HHIP在骨質疏松癥中的甲基化狀態以及與疾病的關系仍不清楚。本研究首先探討SOP患者外周血中刺猬信號分子的表達變化，并進一步通過探討HHIP的甲基化與SOP患者血鈣和骨代謝標志物表達的關系，分析刺猬信號參與調控骨質疏松癥的作用和機制，旨在為骨質疏松的發生機制和靶向治療提供新的實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年7月～2019年7月我院收治的102例漢族老年SOP患者為觀察組，并選取同期于我院體檢中心體檢的100例漢族老年健康者為對照組。記錄研究對象的性別、年齡、身高、體質量指數(BMI)一般資料。 納入標準：①患者診斷與中國人OP診斷標準專家共識(2014版)相符，骨量峰值低于2個標準差。②90 d內未服用影響骨代謝的激素或其他藥物[12]。排除標準：①SOP患者同時患有如糖尿病、甲狀腺機能亢進、甲狀旁腺功能亢進等疾病。②惡性腫瘤患者。③患有慢性胃炎、腸炎、佩吉特氏病、類風濕關節炎及強直性脊柱炎者。④肝腎功能異常者。⑤12個月內出現意外導致運動障礙者。本研究經過我院醫學倫理委員會認定符合醫學倫理，并與所有參與者及家屬簽署了知情同意書。

1.2 試劑與耗材 I型前膠原氨基端肽(P1NP)和β-骨原交聯(β-CrossLaps)ELISA試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司。血Ca2+檢測試劑盒購于中國中生北控生物科技有限公司。EDTA抗凝采血管(貨號367525)購于美國BD公司；Ficoll淋巴細胞分離液(貨號AS1114546)購于挪威Axis-Shield公司。RPIM-1640培養基(貨號SH30809.01B)購于美國Hyclone公司；RNA逆轉錄試劑盒(DBI-2220)購于上海凱學生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒(AOPR-1200)購于美國Genecopies。

1.3 P1NP、β-CrossLaps及血Ca2+水平檢測 空腹抽取所試對象早晨靜脈血2 mL，按照廠家說明，采用美國Bio-Rad酶聯免疫分析法檢測P1NP和β-CrossLaps的水平。使用美國羅氏公司Cobas 8000酶標儀并嚴格按照血Ca2+試劑盒提供的說明書檢測對照組和觀察組的血Ca2+。

1.4 外周血單個核細胞分離 收集抗凝外周血，利用Ficoll淋巴細胞分離液密度梯度離心分離外周血細胞。將外周血離心后，在離白細胞層約5 mm處停止血漿吸取。用無菌移液管向剩余標本中加入等體積的RPIM-1640培養基稀釋，反復倒置混合。用無菌的移液管稀釋上述標本，加入含有淋巴細胞分離液的離心管中。室溫下，在2200 rpm的離心機中離心20 min。離心完成后棄去上清，離心管中收集外周血單核細胞，加入RPIM-1640培養基混勻，計數細胞。將剩余的細胞離心冷凍存儲。

1.5 熒光定量PCR檢測外周血單個核細胞SHH、PTCH1、SMO、Gli、HHIP的mRNA表達 使用Trizol一步法提取細胞總RNA，逆轉錄后得到cDNA，使用磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH)作為熒光定量PCR檢測基因表達的內參基因，進行熒光定量PCR檢測。SHH、PTCH1、SMO、Gli、HHIP基因的熒光定量PCR引物，見表1。PCR反應條件95 ℃預變性8 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火22 s，72 ℃延伸34 s，共42個循環。每個樣本重復檢測3次。使用2-△△Ct表示mRNA相對表達量。

表1 Hedgehog通路相關基因引物序列

1.6 外周血單個核細胞HHIP啟動子區甲基化檢測 采用蛋白酶k -酚/氯仿法提取兩組單核細胞基因組DNA，用紫外分光光度計D(260)/D(280)分析DNA的純度。利用甲基化敏感酶和甲基化依賴酶消化法檢測HHIP基因啟動子區甲基化，結合RTqPCR法分析P16。用甲基化敏感酶HhaI和甲基化依賴酶McrBC對各組DNA樣品進行酶切，以非酶消化樣品為對照。甲基化敏感酶HhaI特異性識別和切割非甲基化CGCG位點，甲基化依賴性酶McrBC特異性識別和切割PumCG(N40-3000)位點。體系為：2 μL限制性酶，10×NEB緩沖液3.0 μL，1 mmol/l GTP，BSA 100 μg/mL，DNA 2 μg，去離子水稀釋至20 μL，37 ℃消化16 h，65 ℃滅活20 min。

首先設計目標基因CpG區擴增的引物，在HHIP基因CpG島區域，擴增區域同時包含甲基化敏感酶和甲基化依賴酶切位點。引物序列為:上游引物(HHIP-MF) 5′- TGCTGTCTCGCTTCTG-3′，下游引物(HHIP-MR) 5′-TGGCGTTCTCTTCGCTTG-3′，擴增片段長度為183 bp。總RTqPCR反應體系為15 mol/L：消化產物2 mol/L，HHIP-MF和HHIP-MR引物各1 mol/L，2倍PCR master mix 3.0 mol/L，dNTP 1 mol/L，去離子化的/l H2O 8 mol。反應條件為：95 ℃ 10 min， 95 ℃ 25 s，60 ℃ 65 s， 43個循環。在72～100 ℃之間，每度取8個熒光采集點，繪制溶解曲線。結果判斷:如果使用DNA樣本和RTqPCR檢測特定片段的擴增，但沒有放大McrBC消化后，然后判定樣品甲基化；如果沒有放大后鐵道Ⅰ消化和McrBC如果放大積極限制性內切酶消化后，為未發生甲基化。Ct值≥35視為無放大。

1.7 DNA亞硫酸氫鹽修飾及測序 為驗證單核細胞基因組DNA的甲基化狀態，使用經典的亞硫酸氫鹽處理和測序方法。檢測前用亞硫酸氫鈉處理DNA樣品，用Winzard DNA凈化樹脂試劑盒回收純化DNA。亞硫酸氫鹽測序引物序列為：上游引物HHIP 正義：GTGCGGATACATGAGTGCGTG，下游引物HHIP反義：CCCTACTATTACTCGCTTA，擴增產物243 bp。總反應體系為25 μL，含100 ng經亞硫酸氫鈉處理的DNA，每個引物25 pmol/l，2×PCR混合12.5 μL，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 m s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個周期；72℃ 5min，經2%瓊脂糖凝膠電泳分離純化，然后送到上海測序。

2 結果

2.1 一般資料比較 兩組性別、年齡、身高等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 外周血單個核細胞中刺猬信號通路相關基因的表達 與對照組相比，觀察組刺猬信號通路相關基因SHH、PTCH1、SMO、Gli1、Gli2 mRNA在單個核細胞中下調(均P<0.05)，見圖1A～B。與對照組相比，HHIP的mRNA在觀察組單個核細胞中上調約4倍(P<0.01)，見圖1A、C。

圖1 骨質疏松癥患者和健康者外周血單個核細胞中刺猬信號通路相關基因的mRNA水平

注:A. 蛋白印跡圖；B. SHH、PTCH1、SMO、Gli1、 Gli2的mRNA水平；C.HHIP的mRNA水平。與對照組比，①P<0.05

2.3HHIP基因啟動子區甲基化水平 甲基化實驗結果表明，觀察組外周血單個核細胞中HHIP基因啟動子區為低甲基化狀態。首先，對照組外周血單個核細胞基因組DNA經HhaⅠ酶切后PCR擴增陽性，(Ct值<30個循環)，而經McrBC酶切后無擴增(Ct值>35個循環)，HHIP基因啟動子區呈高甲基化狀態。其次，觀察組中外周血單個核細胞基因組DNA經HhaⅠ酶切后PCR無擴增(Ct值>35個循環)，而經McrBC酶切后擴增陽性(Ct值<30個循環)，兩組基因HHIP基因啟動子區CpG島甲基化水平分布圖，見圖2。觀察組基因HHIP啟動子區CpG島平均甲基化率為(11.36%±1.07%)，對照組平均甲基化率為(16.88%±0.92%)。與對照組比，觀察組HHIP基因啟動子區CpG島的甲基化率下調(P=0.013)。

圖2 HHIP基因啟動子區 CpG島甲基化水平分布圖

2.4 甲基化狀態的亞硫酸氫鹽測序驗證 將兩組外周血單核細胞基因組DNA用亞硫酸氫鹽修飾后，通過PCR擴增HHIP基因的啟動子區域。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，兩組PCR產物的條帶均為243 bp，條帶長度與預期片段長度一致。PCR擴增產物測序后，將測序結果與HHIP基因啟動子區原始序列進行比對。驗證結果中對照組HHIP基因啟動子區CpG位點發生甲基化而未被亞硫酸氫鹽所修飾。而觀察組HHIP基因啟動子區CpG位點呈低甲基化水平。

2.5HHIP基因甲基化與老年骨質疏松癥相關性分析 觀察組血清PINP含量[(46.1±5.2)ng/mL]顯著高于對照組[(22.1±4.5)ng/mL](t=25.1，P=0.002)，見圖3A。與對照組[(0.57±0.08)]ng/mL]相比，觀察組血清β-CrossLaps[(1.08±0.21)ng/mL]含量升高(t=9.94，P=0.012)，見圖3B。與對照組[(3.12±0.23)mmol/L]相比，觀察組[(2.31±0.11)mmol/L]的血鈣含量下調(t=11.45,P=0.017)，見圖3C。

圖3 骨質疏松癥患者和健康者血清PINP

觀察組患者外周血HHIP表達與其甲基化狀態呈負相關(P<0.05)。且觀察組患者外周血HHIP甲基化水平與血清P1NP、血清β-CrossLaps呈負相關(均P<0.05)，見表3、圖4。

表3 HHIP的甲基化與血清P1NP和β-CrossLaps的相關性

圖4 HHIP的甲基化與血清P1NP和β-CrossLaps的相關性

3 討論

本研究觀察了102例漢族老年骨質疏松癥中HHIP啟動子區的甲基化水平，發現老年骨質疏松癥組的HHIP的甲基化水平普遍低于對照組，與HHIP的表達呈負相關，并且與骨吸收標志物P1NP和β-CrossLaps負相關，這表明刺猬信號基因HHIP介導老年骨質疏松癥。

除HHIP外，在觀察組中其余基因SHH、PTCH1、SMO、Gli1、Gli2表達均降低，因此推測低水平刺猬信號對老年性骨質疏松發展可能有利。Runx2基因調節骨形成蛋白如骨鈣素OC、骨橋蛋白OPN、骨唾液蛋白BSP表達，Osx位于Runx2的下游，在成骨細胞和軟骨細胞中均有表達，而Runx2和Osx兩者均可被刺猬信號正向調節，主要是促進MSCs向成骨細胞分化[3]。Oliveira等[3]證實，在普通條件下培養的人骨髓間充質干細胞可在刺猬信號通路激活劑紫癜素的刺激下分化為成骨細胞，與成骨細胞分化相關的基因如Runx2表達上調，但成骨抑制基因SMAD3的表達降低。另外，刺激信號通路中的Gli2蛋白促進Runx2的表達，并誘導小鼠間充質干細胞C3H10T1/2分化為成骨細胞[13]。相反，抑制刺猬信號可抑制骨髓間充質干細胞的成骨分化。用環丙胺抑制刺猬信號可誘導斑馬魚胚胎骨化喪失，成骨細胞分化標記物Runx2和Osx在軟骨膜中的表達降低，下調刺猬信號的下調抑制骨髓間充質干細胞分化成成骨細胞[14-16]。本研究表明在SOP中，刺猬信號通路被抑制，從而Runx2對MSCs成骨分化的促進作用被削弱。而且，刺猬信號通路的抑制很可能是與HHIP啟動子區甲基化降低導致的HHIP升高有關。

骨代謝是一個動態的生物過程，骨重塑在整個生命過程中都是活躍的，被復雜的調節系統調控。PINP由成骨細胞分泌，對Ⅰ型膠原代謝產物的形成非常重要，與骨形成有密切關系；β-CrossLaps是Ⅰ型膠原分解的產物，是骨吸收的關鍵指標[17]。

本研究中PINP和β-CrossLaps的水平在觀察組中明顯增高，作為Hedgehog抑制因子，觀察組中HHIP的表達顯著升高，與其啟動子區甲基化水平負相關。研究表明，刺猬信號通路刺激破骨細胞代謝并調節凋亡[18-20]。與此一致的是，HHIP啟動子區甲基化與骨吸收標志物P1NP和β-CrossLaps負相關，表明HHIP啟動子區甲基化參與調節老年性骨質疏松癥中骨的代謝平衡。

本研究存在的缺陷：選取的102例漢族SOP患者與100例健康漢族人群進行比較。因骨質疏松癥的發生、發展受多種復雜因素的影響，因此需要進一步納入更大的樣本，從而分析HHIP甲基化與SOP的關系。另一方面，本研究是一項橫斷面研究，HHIP甲基化水平與SOP發生、發展的動態關系尚不清楚，需要更深入的研究。

4 結論

本研究結果顯示，漢族老年骨質疏松癥患者外周血單個核細胞中HHIP的啟動子區甲基化水平顯著降低，與血清P1NP和β-CrossLaps含量呈負相關。這表明，老年骨質疏松癥患者外周血中基因甲基化水平很可能參與骨代謝和疾病發展，此研究結果為骨質疏松癥的診斷和治療提供了潛在的新靶點。