EGFR和KRAS在肺腺癌和肺鱗癌中的突變差異和臨床意義

常瑩，曹陽，孔薇薇

(聯勤保障部隊第967醫院腫瘤科，遼寧 大連 116000)

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占85%以上，早期NSCLC隱匿性高，多數患者明確診斷時癌癥已進展至中晚期[1]。表皮生長因子受體(EGFR)突變基因作為NSCLC中最常見的驅動基因，相關酪氨酸激酶抑制劑的問世及臨床應用，引領肺癌的治療手段從手術、化療、放療走向了分子靶向治療的新階段[2-3]。隨著基因檢測技術以及腫瘤相關分子信號轉導通路的發展，肺癌相關驅動基因被相繼發現，NSCLC的分子基因譜不斷更新，除EGFR外，還包括鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)等。KRAS是EGFR信號通路的下游調控基因，KRAS突變是導致患者對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)耐藥的重要原因之一[4]。因此，EGFR和KRAS基因突變狀態的鑒別對NSCLC的分子靶向治療至關重要，但臨床實踐中往往因無法獲取足夠的檢測標本，進而導致EGFR和KRAS基因突變情況的檢測受阻。本研究擬探討NSCLC患者EGFR和KRAS基因突變狀態與臨床病理特征的相關性，以期為無法進行EGFR、KRAS突變檢測的患者應用EGFR-TKIs提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年6月至2018年6月聯勤保障部隊第967醫院行肺癌根治性手術的120例NSCLC患者為研究對象。納入標準：(1)均經組織病理學明確為NSCLC；(2)年齡≥18歲；(3)本研究經醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。排除標準：(1)合并心、肝、腎、腦等功能障礙者；(2)有其他惡性腫瘤合并史者；(3)臨床資料不完整者。所有病例年齡32～81歲，平均(55.84±8.77)歲；男性74例，女性46例；有吸煙史39例，無吸煙史81例；臨床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期43例，Ⅲ期38例。

1.2 研究方法

使用核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)分離試劑盒(廈門艾德生物醫藥有限公司，貨號ADx-FF04)提取RNA，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，將石蠟切片樣本(≥5片)放入1.5 mL離心管內，依次使用二甲苯脫蠟、蛋白酶消化后提取總核酸，然后分離純化RNA；將石蠟切片中提取的RNA以逆轉錄試劑盒(TAKARA，貨號RR037A)逆轉錄為互補脫氧核糖核酸(cDNA)后，采用特異性引物經熒光聚合酶鏈式反應(PCR)儀(Stratagene MX 3000P)檢測EGFR和KRAS基因突變，人EGFR基因突變檢測試劑盒(貨號ADx-E03)和人KRAS基因突變檢測試劑盒(貨號ADx-KR01)均購自廈門艾德生物醫藥有限公司；引物設計參考文獻[4]，見表1；反應體系20 μL：模板2.7 μL，Taq酶0.3 μL，反應混合液17.0 μL；擴增參數：95 ℃ 5 min進行一個循環；95 ℃ 25 s、64 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s進行15個循環；93 ℃ 25 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 20 s進行31個循環；收集熒光信號，根據說明書判讀原則進行結果判定，即當樣品Ct值小于陰性臨界值時為陽性。所有患者術后定期門診隨訪觀察兩年，記錄患者隨訪期內復發、轉移和死亡情況。主要觀察終點為無病生存期(disease free survival，DFS)，指術后第1天至患者出現復發、進展或死亡的時間。

表1 EGFR外顯子19～21及KRAS外顯子2引物序列

1.3 統計學分析

使用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計數資料采用[n(%)]表示，組間比較采取χ2檢驗或Fisher精確檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，并使用Log-rank法進行顯著性檢驗。所有檢驗資料均采取雙側檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC患者EGFR和KRAS基因突變情況

120例NSCLC患者中，45例(37.50%)檢出EGFR基因突變，11例(9.17%)檢出KRAS基因突變。45例EGFR基因突變中，以21外顯子L858R突變和19外顯子Del突變為主，分別占48.89%(22/45)、40.00%(18/45)；其余包括20外顯子INS、21外顯子L861Q突變，分別占4.44%(2/45)、2.22%(1/45)，及2例聯合突變，分別是19外顯子Del聯合20外顯子T790M突變1例，19外顯子Del聯合21外顯子L858R突變1例。11例KRAS基因突變中，均為外顯子2突變，包括Gly12Cys突變5例，Gly12Asp突變3例，Gly12Ala突變1例，Gly12Ser突變1例，Gly12Val聯合Gly12Arg突變1例。

2.2 EGFR和KRAS基因突變與NSCLC患者臨床病理特征的關系

EGFR基因突變率在不同年齡、臨床分期、分化程度患者比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，女性患者EGFR突變率高于男性患者(P<0.05)，腺癌患者EGFR基因突變率高于鱗癌患者(P<0.05)，無吸煙史的患者EGFR突變率高于有吸煙史者(P<0.05)。KRAS基因突變在不同年齡、臨床分期、分化程度患者比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，男性患者KRAS突變率高于女性患者(P<0.05)，腺癌患者KRAS基因突變率高于鱗癌患者(P<0.05)，有吸煙史的患者KRAS突變率高于無吸煙史者(P<0.05)。見表2。

表2 EGFR和KRAS基因突變與NSCLC患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 EGFR和KRAS基因突變與NSCLC患者預后的關系

對EGFR、KRAS基因突變型和野生型患者生存資料使用Kaplan-Meier生存分析。結果顯示，EGFR突變型和EGFR野生型的患者術后2年無病生存率(71.11%vs.57.33%)比較，差異無統計學意義(Log-rankχ2=2.381，P>0.05)。KRAS突變型和KRAS野生型的患者術后2年無病生存率(45.46%vs.64.22%)比較，差異無統計學意義(Log-rankχ2=2.608，P>0.05)。見圖1。

3 討論

得益于針對EGFR突變的靶向藥物，晚期NSCLC的分子靶向治療取得了重大突破。KRAS驅動基因突變能引起EGFR信號通路持續激活而加速腫瘤細胞增殖[5]。KRAS基因突變與NSCLC對吉非替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI類靶向藥物的耐藥性密切相關。2019版美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)非小細胞肺癌指南指南[6]指出，EGFR、KRAS基因突變是EGFR-TKIs療效的預測指標，臨床上患者使用EGFR-TKI類靶向藥物前須進行相關基因突變的檢測。而對于部分不能進行EGFR、KRAS突變檢測的患者，總結與EGFR、KRAS突變相關因素，將有助于為臨床應用EGFR-TKIs提供參考依據，從而最大限度地使患者獲益。

本研究顯示，EGFR基因突變率為37.50%，且突變類型以21外顯子L858R突變和19外顯子Del突變為主；而張玉萍等[7]報道國內山東濰坊地區EGFR基因突變率約為42.24%，略高于本研究，且突變以19和21外顯子為主，比例高達87.85%；楊長紹等研究[8]表明，云南宣威地區EGFR基因突變以20和21外顯子為主，占51.40%。由此可見，EGFR基因突變率和突變類型具有較明顯的地域性。另外，本研究還發現女性、腺癌及無吸煙史的患者EGFR基因突變率更高，與既往報道[9-10]相符。KRAS基因突變狀態可以為EGFR-TKIs藥物適用人群提供重要參考[11]。KRAS常見突變主要包括外顯子2的12和13密碼子、外顯子3的61密碼子[12]。本研究中，KRAS基因突變率為9.17%，均為外顯子2第12位密碼子的突變，由于KRAS基因突變率較低，本例中受限于樣本數量，僅發現部分常見的突變類型，且KRAS基因突變率多發于男性、腺癌及有吸煙史的患者，而與患者年齡、臨床分期、分化程度無明顯相關性。綜合分析患者的臨床特征發現，EGFR和KRAS基因突變均好發于腺癌患者，而在鱗癌患者出現較少，兩者的發生在臨床特征上存在著一定的互斥性，其中EGFR突變多發于女性、無吸煙史人群，而KRAS基因突變好發于男性、有吸煙史的人群，且尚無患者同時檢測出EGFR和KRAS基因突變，與既往研究[13]結果相符。

本研究對EGFR突變型與野生型患者生存資料進行Kaplan-Meier生存分析，發現突變狀態無法顯著影響患者預后生存。然而，針對EGFR等驅動基因的靶向藥物可改善突變人群的預后；但KRAS基因突變可導致患者對EGFR-TKIs耐藥，進而導致患者預后更差。而本研究中EGFR、KRAS突變狀態與預后無關的原因可能在于獲得的陽性樣本量較小，故在生存分析時可能由于統計效能偏低，存在假陰性結果的可能，后續研究可考慮擴大研究人群、增加樣本量，以提高分析結果的準確性。

綜上所述，NSCLC患者的EGFR和KRAS基因突變均好發于腺癌患者，而在鱗癌患者出現較少，其中，EGFR突變好發于女性、無吸煙史人群，而KRAS基因突變好發于男性、有吸煙史的人群。