P物質的表達減少減輕A2腺苷受體基因敲除小鼠 心肌梗死后的神經病理性疼痛

曾小林，王 艷，盧加發，李海鷹，韓 偉

冠心病是全世界死亡的主要原因，以往對心肌梗死的研究大多集中在病因病機和治療上，對疼痛癥狀本身在發病機制上的研究較少。心絞痛是一種內臟痛[1]，是一種極其復雜的病理過程。在臨床上，有一部分心絞痛患者因嚴重的彌漫性病變、小血管病變、再狹窄以及移植血管橋血栓等原因被排斥在血運重建手段之外。針對這些頑固性的心絞痛，其臨床治療效果不佳。已有研究表明，心肌梗死的病人所經歷的頻繁的嚴重的心肌缺血性疼痛與心肌壞死時大量的P物質（Substance P，SP）釋放到心肌內有關[2-3]。Zhang[4]和Guo等[5]研究表明，缺血區SP的表達明顯高于非缺血區。心絞痛疼痛刺激感覺神經末梢會釋放大量的疼痛遞質，如SP、降鈣激素基因相關肽（Calcitonin-Gene-Related Peptide，CGRP）等，可產生神經源性反應，加重心肌缺血缺氧損傷。急性心肌缺血痛覺干預，阻斷疼痛因子和介質如腺苷A2A受體（Adenosine A2A receptor）和SP受體神經激肽1（Neurokinin-1，NK-1）的過度表達，可能有心肌保護作用。

心絞痛疼痛主要通過腺苷A1受體傳導，這種作用可通過SP增強[6]。目前已發現四種腺苷受體（Adenosine Receptors，AR），即腺苷A1、A2A、A2B和A3受體。根據心血管疾病的解剖分布主要與A1受體和A2A受體有關。2004年Kelly[7]和Lopes[8]通過Western blot發現并證實A2A受體存在于相對較低水平的體感皮層；Ledent[9]研究表明，A2A受體敲除小鼠在熱量測試中表現出低痛覺。因此，我們推測A2A受體可能參與了心絞痛疼痛的過程[10]，但這方面的研究尚未引起重視。這兩種腺苷受體刺激心肌組織的感覺神經末梢，神經末梢向心肌組織釋放大量的痛因子，如SP、CGRP等，形成一系列的痛反應。

本研究采用藥物（拮抗劑）干預和基因敲除的方法，探討腺苷A2A受體和P物質在心肌梗死疼痛中的作用，阻斷兩個最重要因子的過度表達，可能具有心臟保護作用，為心絞痛疼痛干預提供理論依據，探索治療心絞痛特別是頑固性心絞痛的新方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組所有動物實驗均符合國家科學院實驗動物資源研究所生命科學委員會國家研究所頒布的《實驗動物護理和使用指南》委員會，所有試驗操作遵循動物使用相關倫理要求。實驗在成年C57BL/6J腺苷A2A基因敲除小鼠（Knock Out，KO）和野生型小鼠（Wild-Type C57BL/6J，WT）上進行，小鼠體重20～30 g，雌雄不限，購自溫州醫科大學實驗動物中心，通過永久性結扎左冠狀動脈前降支誘發急性心肌梗死。

1.1.1 分組實驗將36只野生型小鼠隨機分為3組，每組12只。3組分別為（1）假手術組（Sham Group）加生理鹽水（Normal Saline，NS）（Sham Group + NS）；（2）急性心肌梗死模型組加生理鹽水（WT+NS）；（3）急性心肌梗死模型組加L-703606（1 mg/kg/天）（WT+SP）。將24只腺苷敲除小鼠隨機分為2組，每組12只。兩組分別為（1）急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）模型組加生理鹽水（KO+NS）；（2）AMI模型組加L-703606（1 mg/kg/天）（KO+SP）。所有小鼠均于術后半小時腹腔注射0.2 ml生理鹽水，于第14天定時注射。

1.2 實驗材料和儀器試劑分光光度計（型號UV-1600）、凝膠文件系統（型號Bio Best 200e）、Trizol（型號Invitrogen Life Technologies）、Realtime PCR Instrument（型號ABI7700）、動物呼吸器（型號DHG-30）、心電圖（型號ECG6511）、超聲儀器（型號65l8w）、2,3,5-三苯基-2H-四唑氯化物（型號TTC）、NK1受體拮抗劑（型號L-703606）、SYBR Green I、PCR熱循環儀。

1.3 建立心肌梗死模型小鼠用氯胺酮100 mg/kg腹腔內麻醉，在手術燈光下用20號靜脈留置針套管插管，連接小動物呼吸機輔助呼吸，潮氣量2～3 ml，通氣頻率90～100次/min。用自制的開胸器開胸，結扎左冠狀動脈前降支近端。術者觀察到Ⅱ導聯立即（Statim/Immediately，ST）段抬高，左室前壁顏色明顯變深灰色或紫色，收縮力減弱或消失，以上特征是造模成功的標志。停止機械通氣直至恢復自主呼關胸縫合胸壁。假手術組也進行了同樣的手術，只是冠狀動脈周圍的縫線沒有打結。

1.4 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（2，3，5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）染色取心肌標本作冠狀切片，室溫下用2%TTC染色20 min，數碼相機拍攝，并進行統計學分析。正常心肌組織呈鮮紅色，心肌梗死組織呈白色。

1.5 酶聯免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）試驗測定心肌組織IL-1水平分別于術前24 h、術后24 h、術后14天取心肌組織，使用ELISA試劑盒測定心肌組織IL-1水平的表達。

1.6 福爾馬林疼痛試驗術后第14天，在小鼠左后足底部皮下使用微型注射器注射5%的福爾馬林溶液20 μL后， 立即置于透明的玻璃缸中觀察，實驗過程中避強光，保持環境安靜，使用數碼照相機記錄。以舔注射足時間為小鼠痛反應指標。分別記錄小鼠在0～5 min和15～30 min的累積舔足次數，分別代表I相和Ⅱ相疼痛強度。行為學觀察采用雙人雙盲法，即觀察者不知道實驗分組的具體情況。

1.7 qRT PCR檢測用TRIzol試劑盒從心肌組織中提取總核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA），然后用轉錄酶反轉錄成互補脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）。根據試劑盒的說明，使用SYBR進行實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）?預混料Ex TaqTMII套件和β-肌動蛋白被選為一個內部參考基因。相對定量法（2-△△CT法）計算目的基因的相對轉錄水平，每個實驗重復3次。SP和β-actin的引物列表，如表1所示。

表1 SP和β-actin的引物列表

1.8 統計分析所有數據用SPSS 19.0統計軟件處理。實驗數據以平均值表示±標準差（Standard Deviation，SD）。正態性檢驗后，采用單因素方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）比較多組樣本均值。P<0.05，差異顯著。

2 結 果

2.1 成功構建小鼠心肌梗死模型采用開胸結扎小鼠冠狀動脈前降支建立小鼠急性心肌梗死模型。心電圖結果，如圖1所示，冠脈結扎前組正常。急性心肌梗死后1 min和5 min，ST段明顯升高。術后第14天可見Q波的形成，心臟彩超結果如圖2所示。顯示術后14天左室壁運動明顯減弱，變薄，左室腔變大，射血分數明顯降低。此外，TTC染色結果，如圖3所示，顯示假手術組小鼠心肌呈磚紅色；急性心肌梗死模型組為淺白色。基于以上結果，我們成功構建了小鼠急性心肌梗死模型。

圖1 小鼠急性心肌梗死心電圖結果

圖2 小鼠急性心肌梗死心臟彩超結果

圖3 小鼠心肌梗死TTC染色

2.2 腺苷A2A受體敲除及P物質對IL-1水平在小鼠心肌組織中的表達ELISA結果表明，與假手術組相比，WT+NS組心肌組織IL-1水平明顯升高；與WT+NS組比較，WT+SP組和KO+NS組心肌組織IL-1水平明顯低于WT+NS組，其中WT+SP組高于KO+NS組。說明阻斷了腺苷A2A受體和P物質，IL-1表達水平明顯下降，如圖4所示。

圖4 ELISA法測定心肌組織的IL-1水平

2.3 福爾馬林疼痛試驗福爾馬林刺激模型自Dubuisson和Dennis[11]在1977年建立以來，第I相行為反應在刺激后立即出現，持續約5 min，是直接化學刺激引起。之后動物處于安靜狀態，稱之為間歇期。第II相行為反應在刺激15～30 min,后疼痛反應逐漸減退，Ⅱ相是炎癥反應所致。福爾馬林Ⅱ期疼痛實驗中，WT+NS與WT+SP比較，小鼠舔體次數明顯減少（P<0.01）。表明P物質阻滯劑能明顯減輕AMI小鼠的疼痛。此外，KO+NS組的舔肉次數明顯少于WT+NS組（P<0.01），KO+SP組的舔足次數明顯少于WT+SP組（P<0.05）如圖5所示。結果證實了A2A受體敲除后，AMI小鼠的疼痛減輕，而P物質阻滯劑能進一步減輕A2A受體敲除后小鼠的疼痛。

圖5 福爾馬林實驗

圖6 P物質的RT-PCR法定量結果圖

2.4 腺苷A2A受體敲除和P物質對小鼠心肌組織SP表達的影響 結果表明，如圖5所示，與假手術組相比，WT+NS組心肌組織SP的mRNA和蛋白表達水平顯著升高；與WT+NS組比較，WT+SP組和KO+NS組心肌組織SP的mRNA和蛋白表達水平明顯降低，其中WT+SP組高于KO+NS組；KO+NS組和KO+SP組之間沒有明顯差異。

3 討 論

冠心病是危害我國人民身體健康的“頭號殺手”，以往對心肌梗死的研究大多集中在病因病機和治療上，對疼痛癥狀本身在發病機制上的研究較少。本實驗通過結扎冠狀動脈前降支成功建立急性心肌梗死模型。在福爾馬林試驗中[11]，腺苷A2A受體和P物質影響福爾馬林疼痛的Ⅱ期，而不影響Ⅰ期。以往的研究表明，心絞痛主要通過腺苷A1受體，這種作用可被SP增強，而腺苷A2受體的激活通過增加產生促痛或增強疼痛的特性[12]。Ledent[9]研究表明，A2A受體敲除小鼠進行了痛覺減退溫度熱試驗，與我們福爾馬林試驗的結果相同。福爾馬林試驗Ⅱ期為局部炎癥和炎性疼痛物質的毒性刺激，提示腺苷A2A受體和SP參與了心絞痛的神經源性炎癥；Longhurst[13-14]等提出在心肌缺血疼痛時存在神經源性假說，大量的化學介質刺激心臟感覺神經后可能導致心臟傳入通路激活，多種心血管物質和神經末梢的促炎介質釋放，導致“神經源性炎癥”反應，加重心肌損傷；阻斷疼痛因子的過度表達可能具有心肌保護作用。SP是傷害性信息初級傳入的神經遞質，SP與許多炎癥細胞、炎癥介質和細胞因子之間相互作用，表現在:（1）SP調節多種細胞產生多種細胞因子，促進單核細胞分泌IL-1、IL-6等炎癥因子;（2）炎性介質和炎性細胞也能刺激SP從外周感覺神經末梢分泌，因而在SP與炎癥介質之間形成了相互作用的效應，使炎癥反應的級聯效應得以實現。本實驗測定了IL-1一個炎癥因子，其中腺苷A2A受體敲除小鼠和P物質（WT+SP組）的IL-1表達最少，進一步驗證了心絞痛的神經源性假說。Gaspardone A[15]研究表明，大量的SP釋放到心肌梗死患者的心肌中出現頻繁的劇烈疼痛，應用SP受體（NK-1）拮抗劑CP-99、994明顯減輕術后疼痛[16]，提示傷害性信號轉導通路中的SP是一種重要的神經遞質。我們的結果表明，阻斷腺苷A2A受體和SP的過度表達可以減少福爾馬林Ⅱ期舔后爪的次數，這個間接提示阻斷疼痛因子的過度表達可以減少心肌梗死面積。痛覺干預可減少交感神經過度活動，減輕疼痛和焦慮，減輕神經內分泌應激反應，降低心肌耗氧量，達到心肌保護的目的。

5組小鼠的P物質的RT-PCR法定量結果提示，基因敲除小鼠和野生型小鼠加生理鹽水組，SP的表達有顯著差異；兩組敲除小鼠之間的的P物質表達量無差異，與觀察到福爾馬林試驗相符，兩組敲除小鼠在II相期間舔足次數無統計學差異。所以我們推測，在急性心肌梗死時，自身腺苷大量釋放引起劇烈的疼痛，刺激周圍神經末梢的P物質高度表達，進一步加劇疼痛。而阻斷了腺苷A2A受體的表達，腺苷釋放明顯減少，這樣P物質的表達也明顯減少，可能與減少IL-1、IL-6等炎癥因子的表達相關，如兩者之間具體的相互作用的機制需進一步探討。

綜上所述，我們成功構建了急性心肌梗死小鼠模型，腺苷A2A和P物質參與了心肌梗死的病理生理過程，阻斷腺苷A2A受體和P物質受體神經激肽1的過度激活可降低心絞痛的程度，可能有心肌保護作用。