β-胡蘿卜素乳液凝膠微球制備與理化特性研究

江連洲 廖培龍 連子騰 田 甜 嚴 仁 王 歡

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

β-胡蘿卜素是一種脂溶性的天然色素，具有較強的抗氧化活性，是維生素A的前體物質，在高溫、光照和氧氣條件下易被氧化和降解[1]，從而喪失生物活性。由于β-胡蘿卜素水溶性差、生物利用度相對較低，故在食品領域的應用受到限制。研究發現，β-胡蘿卜素在人體腸道部位可被有效吸收[2]，但在多變環境(如pH值、離子強度、溫度等)下乳液變得不穩定，β-胡蘿卜素易發生氧化或降解，大大降低了它的利用率[3]。研究者們采取了不同的方法來提高β-胡蘿卜素的利用率，如微膠囊化[4]、乳液凝膠[5]等。

靜電層層自組裝技術通過建立一個保護屏障來封裝生物活性物質，被廣泛應用于食品工業領域。文獻[6-7]研究表明，利用靜電層層自組裝技術，將多糖吸附在乳液周圍形成包封層，能顯著增強乳液對外界多變環境的抵抗力，進一步提高對生物活性物質的保護能力。此外，離子凝膠化技術通過生物聚合物與離子交聯作用形成凝膠微球運載體系，也能顯著提高生物活性物質的利用率，并延緩釋放。

海藻酸鈉(Sodium alginate, SA)是從海藻中提取的一種酸性陰離子多糖，由(1,4)-β-D-甘露酸(M)和α-L-古魯酸(G)殘基組成[8]。殼聚糖(Chitosan, CS)是一種由甲殼素經脫乙酰化后形成的陽離子多糖[9]。兩種多糖都具有生物相容性、可降解性，被廣泛用于食品、藥品和再生藥物領域。CS與SA可通過靜電相互作用形成聚合物，利用SA與二價陽離子的較強交聯能力制備凝膠微球[10]。將靜電層層自組裝技術與離子凝膠化技術相結合，制備凝膠微球，既可以提高對生物活性物質的包埋率，又可以提高生物活性物質的生物利用率及緩釋效果。文獻[11]以SA與CS為壁材、以維生素B2為模擬藥物，研究了多層凝膠微球的緩釋能力，結果表明，凝膠微球具有良好的緩釋效果。文獻[12]成功制備了延緩脂質氧化、提高脂類氧化穩定性的生物聚集顆粒。目前，關于靜電層層自組裝技術或離子凝膠化技術已有深入的研究，但對兩種技術相結合的研究很少。

本文以大豆分離蛋白為水相、以玉米油為油相制備β-胡蘿卜素乳液，利用靜電相互作用將殼聚糖、海藻酸鈉逐層吸附到乳液外層，形成β-胡蘿卜素三層乳液，再通過離子凝膠化技術利用Ca2+交聯制備乳液凝膠微球。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-胡蘿卜素(純度97%以上)，海藻酸鈉，殼聚糖(脫乙酰度97%以上)，氯化鈣，均來自于北京源葉生物有限公司；脫脂豆粕、玉米油，黑龍江省九三集團有限責任公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

IKA T18型分散機，德國艾卡儀器設備有限公司；SPCH-10型超高壓納米均質機，英國安盛聯合科技有限公司；Delta 320型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Mastersizer 3000型粒度儀、ZS 90s型電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；LSM 710型共聚焦顯微鏡，德國卡爾蔡司股份公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；HH-S26型恒溫水浴鍋，金壇市梅香儀器有限公司；THR-16-A型臺式冷凍離心機，長沙英泰離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1樣品的制備

(1)大豆分離蛋白

將脫脂豆粕粉碎過60目篩，按照液料比10 mL/g，加水混合攪拌，同時用1 mol/L NaOH調節混合液的pH值到8.5，攪拌2 h，然后在9 000g條件下離心20 min，取上清液，并將清液pH值調到4.5，放置到4℃冰箱靜置12 h，然后在9 000g下離心20 min，棄去上清液，將得到的大豆分離蛋白水洗3次，并將pH值調節到7.0，經冷凍干燥后得到大豆分離蛋白粉末，儲存備用。

(2)乳液

將大豆分離蛋白粉末溶于去離子水中(pH值7.0)，磁力攪拌2 h，水化2 h，使其充分溶解，制備2.5%蛋白溶液作為水相；β-胡蘿卜素溶于玉米油中，50℃加熱攪拌1 h并且超聲2 min，使其充分溶解，制備含β-胡蘿卜素(質量分數0.5%)玉米油作為油相，油水兩相按體積比1∶9混合，8 000 r/min粗均質3 min形成粗乳液，在60 MPa下高壓均質3次得到納米乳液，放置4℃冰箱儲存備用。

(3)β-胡蘿卜素雙層乳液

將所制得的乳液與殼聚糖(質量分數為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)以料液比2 g/mL、轉速6 000 r/min快速混合1 min，并用1 mol/L NaOH調節pH值為5.0，制備β-胡蘿卜素雙層乳液。

(4)β-胡蘿卜素三層乳液

將所制得的海藻酸鈉(質量分數為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)與雙層乳液以料液比1 g/mL、轉速6 000 r/min快速混合1 min，并調節pH值為5.0，形成β-胡蘿卜素三層乳液。

(5)乳液凝膠微球

將形成的β-胡蘿卜素三層乳液通過5 mL注射器以10 滴/min的速度滴加到5%的CaCl2溶液中，滴加完成后在CaCl2溶液中繼續交聯30 min，用濾布過濾出凝膠微球并用蒸餾水沖洗除去多余的Ca2+離子，室溫(20℃)下干燥，4℃儲存備用。

1.3.2平均粒徑及電位分析

(1)平均粒徑測定

樣品的平均粒徑使用馬爾文激光粒度儀測定。用蒸餾水作為分散介質，取1 mL樣品并稀釋100倍，設置分析條件為：顆粒(玉米油)折射率1.472，顆粒吸收率0.100，分散劑(水)折射率1.33，激光遮光度10%左右。

(2) ζ-電位測量

取1 mL樣品用相應pH值的蒸餾水稀釋100倍后，用馬爾文ZS 90s型電位分析儀測定ζ-電位，測試參數為：溫度25℃，折光率1.333，激光波長635 nm，外部光纖角18.9°，散射角14.063 6°。

1.3.3濁度測定

通過濁度測定來獲取乳液吸附情況，參照文獻[13]的方法并稍作修改。將制備的乳液、β-胡蘿卜素雙層乳液、β-胡蘿卜素三層乳液靜置24 h后，用pH值為5.0的蒸餾水稀釋100倍，以蒸餾水為空白，用紫外分光光度計在600 nm處測量吸光度。

1.3.4界面蛋白吸附量測定

參照文獻[14]的測定方法并稍作改動。取50 mL待測樣品于離心管中，室溫下離心(11 000g，30 min)，用注射器小心吸取底部清液于另一離心管中，再次離心(11 000g，30 min)，收集下層清液，用Bradford法[15]測定清液中的蛋白質量濃度Ci，界面蛋白吸附量計算公式為

C=C0-Ci

(1)

式中C0——初始乳液中蛋白質量濃度，mg/mL

C——界面蛋白吸附量，mg/mL

1.3.5乳化活性指數和乳化穩定性指數測定

參照文獻[16]方法略作修改。取50 μL樣品加入4 950 μL 0.1 g/L的SDS(十二烷基硫酸鈉)稀釋，在500 nm波長處測吸光度A0，靜置30 min后，再次測定吸光度A30，乳化活性指數和乳化穩定性指數計算公式為

(2)

(3)

式中N——稀釋倍數

ρ——混合液形成前質量濃度，取0.025 g/mL

φ——乳化液中油相體積分數，取10%

EAI——乳化活性指數，m2/g

ESI——乳化穩定性指數，min

1.3.6掃描電鏡觀察

參照文獻[17]的方法，在觀察前，將β-胡蘿卜素雙層乳液和凝膠微球冷凍干燥粉碎，然后表面噴金。用掃描電子顯微鏡觀察樣品的表觀形貌。

1.3.7紅外光譜分析

參照文獻[17]的方法，海藻酸鈉、殼聚糖和冷凍干燥后的乳液凝膠微球研磨成粉末，紅外光譜記錄從500 cm-1到4 000 cm-1，每個光譜以4 cm-1分辨率平均進行64次連續掃描。

1.3.8包埋率測定

準確稱取1 mg β-胡蘿卜素溶于5 mL正己烷，配置成0.1 mg/mL的β-胡蘿卜素母液，然用正己烷分別稀釋成一定濃度梯度的β-胡蘿卜素溶液，以正己烷為空白對照，于450 nm處測量吸光度，繪制得到標準曲線。

參照文獻[18]并作修改，分別取β-胡蘿卜素雙層乳液、β-胡蘿卜素三層乳液1 mL加入4 mL正己烷渦旋1 min后，5 000 r/min離心3 min，取上層液，以正己烷為空白對照，在450 nm處測定其吸光度A1。將萃取后的脂質體懸浮液與3 mL乙醇混合，超聲破乳10 min后，加入4 mL正己烷，5 000 r/min離心3 min，取上層液，以正己烷為空白對照，在450 nm處測定其吸光度度A2，將A1和A2代入標準曲線分別計算游離β-胡蘿卜素含量和包埋β-胡蘿卜素含量。每個實驗做3組平行，β-胡蘿卜素包埋率計算公式為

(4)

式中B0——游離β-胡蘿卜素質量濃度

Bi——包埋β-胡蘿卜素質量濃度

1.3.9體外釋放及釋放動力學研究

參照文獻[17]的方法并稍作修改。分別取2.0 g凝膠微球置于離心管中加入正己烷30 mL。將離心管在37℃下恒溫水浴，每30 min對樣品進行取樣，每次取0.1 mL樣品，然后將相同量正己烷立即加入離心管中，以保持總體積不變。取0.1 mL樣品與4.9 mL正己烷混合，在450 nm處測定吸光度。

參照文獻[19-20]的方法并稍作修改，零級動力學模型、一級動力學模型和基于Fickian擴散的Higuchi模型分別為

Qt=Q0+K0t

(5)

(6)

Qt=Q0+KHt1/2

(7)

式中Qt——時間t中釋放的β-胡蘿卜素的累積量

Q0——溶液中β-胡蘿卜素的初始量

K0——零級釋放常數

K1——一級釋放常數

KH——Higuchi常數

1.4 數據處理和分析

每組實驗重復測定3次，用Origin 2019和SPSS 20.0軟件進行實驗數據的圖表和數據分析。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖質量分數對雙層乳液粒徑、電位及聚集狀態的影響

通過平均粒徑、ζ-電位、PDI(分散指數)及濁度表征雙層乳液的聚集特征。如圖1a(圖中相同圖例、不同字母表示差異顯著，下同)所示，殼聚糖質量分數在0.5%～2%時，隨著質量分數的升高，雙層乳液的平均粒徑及PDI都呈上升的趨勢，且在2.0%時平均粒徑最大，這可能是由于隨著殼聚糖質量分數的增加，殼聚糖分子被吸附到多個乳液液滴表面而引起液滴聚集使粒徑變大[21-22]，形成的雙層乳液粒度分布不均，PDI也變大。與此相反，殼聚糖質量分數在2.5%的平均粒徑及PDI小于2.0%的雙層乳液，結合圖1b可知，這可能是由于殼聚糖將乳液液滴完全包裹，增加了液滴之間的空間排斥和靜電排斥[13]，從而降低了雙層乳液液滴的平均粒徑。

如圖1b所示，未添加殼聚糖的乳液表面呈電中性(-2.26 mV)，這是由于在pH值為5.0時未加入殼聚糖的乳液接近大豆分離蛋白的等電點(pI值為4.5)。加入殼聚糖后，其表面帶有正電荷，這可能是由于靜電和疏水共同作用使殼聚糖吸附到乳液表面[23]。雙層乳液的表面電荷都呈正電荷，殼聚糖質量分數超過2.0%時雙層乳液電位接近飽和且在2.0%時電位絕對值最大(56.21 mV)。雙層乳液的濁度明顯低于未加入殼聚糖乳液的濁度，這可能是由于pH值5.0時未添加殼聚糖的乳液為電中性，使其不穩定而導致濁度較大，加入的殼聚糖形成雙層乳液，增強了液滴間的靜電排斥作用，穩定性增強，使得雙層乳液濁度下降[24]。因此，在殼聚糖質量分數為2.0%時，乳液對殼聚糖的吸附效果最佳。

2.2 殼聚糖質量分數對雙層乳液穩定性的影響

如圖2所示，與未加殼聚糖的乳液相比，0.5%～2.0%樣品中乳化活性指數差異不顯著(P>0.05)，加入殼聚糖后乳化活性指數降低，這可能是因為加入殼聚糖后促進了油滴分裂成更小的液滴，使乳化活性降低[25]。在2.0%時乳化穩定性指數最大，當殼聚糖質量分數達到2.5%，所形成的乳液出現分層現象，乳化穩定性指數最小，最不穩定。因此，在殼聚糖質量分數為2.0%時所形成的雙層乳液穩定性最佳。原因可能是殼聚糖在較低質量分數時，會吸附在雙層乳液液滴周圍使乳化穩定性增加[25]。隨著殼聚糖質量分數增加，在乳液周圍覆蓋的殼聚糖分子趨于飽和[13,26]，存在于乳液體系中過量的殼聚糖會破壞雙層乳液的平衡，引起損耗絮凝，使雙層乳液穩定性降低，這與文獻[27]結果一致。

2.3 殼聚糖質量分數對界面蛋白吸附量及β-胡蘿卜素包埋率的影響

通過對界面蛋白吸附量和β-胡蘿卜素包埋率的測定，來表征殼聚糖對乳液的包埋情況。由圖3可知，當殼聚糖質量分數低于1.5%時，雙層乳液的界面蛋白吸附量隨著殼聚糖質量分數的升高而增加；殼聚糖質量分數超過2.0%時，界面蛋白吸附量趨于穩定(P>0.05)。這是由于隨著殼聚糖質量分數升高，殼聚糖與乳液的靜電相互作用逐漸達到飽和并趨于穩定[28-29]，殼聚糖分布在乳液周圍并完全覆蓋在乳液表面，因此界面蛋白吸附量先升高后平穩。

由圖3可知，殼聚糖質量分數低于1.5%時，β-胡蘿卜素包埋率無顯著變化(P>0.05)，殼聚糖質量分數在1.5%～2.0%時，隨著殼聚糖質量分數升高，β-胡蘿卜素包埋率顯著升高，這可能是隨著殼聚糖質量分數的增加，乳液液滴逐漸被殼聚糖包裹，吸附在外側的殼聚糖層逐漸變得緊密，對β-胡蘿卜素的包埋作用逐漸增強；當殼聚糖質量分數過高，過量的殼聚糖存在于乳液體系中會導致殼聚糖分子間的聚解和解吸[30]，減弱對乳液的包封效果，因此殼聚糖質量分數達到2.5%時，β-胡蘿卜素的包埋率降低。當殼聚糖質量分數為2.0%時，所獲得的雙層乳液對β-胡蘿卜素的包埋率最高，為(64.82±0.31)%。

2.4 海藻酸鈉質量分數對三層乳液粒徑、ζ-電位及聚集狀態的影響

在確定了形成雙層乳液的最佳殼聚糖質量分數為2.0%后，向其中加入陰離子多糖海藻酸鈉形成三層乳液，如圖4a所示，隨著海藻酸鈉質量分數的增加，三層乳液的平均粒徑增大并趨于穩定，且當海藻酸鈉質量分數超過2.0%，平均粒徑的降低無顯著性差異(P>0.05)，原因可能是在靜電相互作用下，帶負電的海藻酸鈉與帶正電的雙層乳液產生吸附且逐漸達到飽和，三層乳液的粒徑變大并趨于穩定。與圖1a相比，三層乳液的整體粒徑大于雙層乳液，這表明加入的海藻酸鈉在一定程度上吸附在雙層乳液上[21]，使其粒徑增大。

如圖4b所示，加入海藻酸鈉形成的三層乳液表面帶負電荷，這表明海藻酸鈉吸附在雙層乳液表面，使其表面電荷由正電變為負電。隨著海藻酸鈉質量分數的增加，三層乳液表面電荷呈現急速增加并趨于穩定，造成這一現象的原因可能是由于靜電相互吸引，海藻酸鈉快速地吸附在雙層乳液表面[31]，海藻酸鈉質量分數越高，形成的海藻酸鈉吸附層越厚，其表面電荷越強；當覆蓋在雙層乳液表面的海藻酸鈉達到飽和后，三層乳液之間的斥力增大就會造成絮凝[32]，使海藻酸鈉層厚度降低，三層乳液粒徑下降。當海藻酸鈉質量分數為2.0%形成的三層乳液最佳。

2.5 海藻酸鈉質量分數對β-胡蘿卜素包埋率的影響

通過對β-胡蘿卜素包埋率的測定，能更好地反映出海藻酸鈉對雙層乳液包覆性能。隨著海藻酸鈉質量分數增加，β-胡蘿卜素的包埋率顯著提高(P<0.05)。當海藻酸鈉的質量分數大于2.0%時，β-胡蘿卜素的包埋率趨于穩定，且在海藻酸鈉質量分數在2.0%時對β-胡蘿卜素的包埋率最高，為(86.75±2.00)%，這一現象表明海藻酸鈉質量分數較低時，由于靜電相互作用，海藻酸鈉吸附在雙層乳液表面，逐漸形成包覆層，三層乳液的粒徑變大，且隨著海藻酸鈉質量分數的增加，海藻酸鈉的包覆層逐漸緊密；當海藻酸鈉質量分數超過一定值時，雙層乳液表面電荷被海藻酸鈉中和[13]，進而阻止了多余的海藻酸鈉吸附在上面，因此對β-胡蘿卜素的包埋率趨于穩定。

2.6 紅外光譜分析

以粒徑、ζ-電位、β-胡蘿卜素包埋率等指標篩選出海藻酸鈉質量分數范圍為1.5%～2.5%，并將制備的三層乳液滴入質量分數為5.0%的CaCl2溶液形成凝膠微球，用紅外光譜測定了海藻酸鈉、殼聚糖及凝膠微球的吸收峰，進一步研究了海藻酸鈉和殼聚糖之間的相互作用(圖5)。在海藻酸鈉(SA)的紅外光譜圖中，3 417.56 cm-1是O—H鍵的拉伸振動，在2 925.49 cm-1和2 849.32 cm-1處，是脂肪族C—H的拉伸振動的結果[33]。在1 416.98 cm-1和1 030.78 cm-1處觀測到的峰分別是COO—的對稱拉伸振動、C—O的伸縮振動[34]。

雙層乳液中具有殼聚糖常見的結構(1 258.5 cm-1和1 064 cm-1)。在2 926 cm-1和2 855 cm-1處出現新的吸收峰是β-胡蘿卜素—CH2振動引起的。這表明β-胡蘿卜素存在于雙層乳液中。當乳液凝膠微球形成時，光譜中的峰變化顯著，殼聚糖在1 597.68 cm-1處的吸收峰消失，這可能是由乳液表面負電荷與殼聚糖—NH3+發生靜電相互作用引起的，表明殼聚糖吸附在乳液表面。殼聚糖的O—H和N—H在3 423.42 cm-1處的拉伸振動向3 420.15 cm-1輕微移動，海藻酸鈉的羧基峰從1 609.02 cm-1移至1 640.76 cm-1，變得更強，這表明海藻酸鈉與殼聚糖之間發生了聚電解質絡合反應[38]。2 926 cm-1和2 855 cm-1這兩處吸收峰是β-胡蘿卜素內部疏水性基團CH2的振動引起的，兩處峰未發生明顯變化，這表明凝膠微球的形成并未對β-胡蘿卜素結構性質產生影響。

2.7 乳液凝膠微球表觀形貌觀察

如圖6所示，干燥的凝膠微球呈球形或近球形(圖6a)，在掃描電鏡下觀察，凍干的乳液凝膠微球皺縮(圖6b)，隨海藻酸鈉質量分數的增加無明顯的變化。對凝膠微球表面觀察發現，雙層乳液表面結構松散(圖6c)，海藻酸鈉質量分數為1.5%時，凝膠微球表面不平整(圖6d)，隨著海藻酸鈉質量分數的增加，凝膠微球結構變得緊實且表面趨向平滑(圖6e、6f)，這表明隨著海藻酸鈉質量分數的增加，凝膠微球的結構變得更加緊密，對β-胡蘿卜素能夠實現更好的包封。

2.8 β-胡蘿卜素乳液凝膠微球的體外釋放

以海藻酸鈉質量分數為1.5%、2.0%、2.5%形成的三層乳液制備乳液凝膠微球為對象，研究其在模擬介質中的積累釋放情況。由圖7可知，在30～60 min，不同質量分數的海藻酸鈉對β-胡蘿卜素釋放方面的影響并無顯著性差異(P>0.05)，在1～2 h內β-胡蘿卜素均呈爆發性釋放，釋放出75%左右的β-胡蘿卜素，這可能是由于凝膠微球在初始階段開始溶脹，導致β-胡蘿卜素在初始階段釋放率較高，文獻[39]的體外釋放實驗同樣觀察到凝膠微球在最初階段呈爆炸式釋放。在3 h后β-胡蘿卜素釋放率降低且三者都進入緩慢和持續性釋放階段；結果表明，運載β-胡蘿卜素凝膠微球具有良好的緩釋效果。

表1從零級、一級和Higuchi動力學模型[19-20]中確定β-胡蘿卜素的釋放動力學參數。基于Fickian擴散機制的Higuchi模型是最合適來表示β-胡蘿卜素從凝膠微球的釋放行為的模型，該模型的決定系數R2高于其他動力學模型，結果表明β-胡蘿卜素在凝膠微球中的釋放主要受自身擴散行為的影響。

表1 釋放動力學模型

3 結論

(1)加入殼聚糖形成的雙層乳液的平均粒徑顯著增大，電位變為正值，殼聚糖與乳液相互吸附。當殼聚糖質量分數為2.0%時，雙層乳液的乳化活性及乳化穩定性最佳，β-胡蘿卜素的包埋率最高，為(64.82±0.31)%；加入海藻酸鈉形成的三層乳液平均粒徑明顯增大，表面電位變為負值，當海藻酸鈉質量分數為2.0%形成的三層乳液對β-胡蘿卜素的包埋率顯著提高，為(86.75±2.00)%。

(2)制備得到的β-胡蘿卜素凝膠微球組分間存在靜電相互作用。隨著海藻酸鈉質量分數的增大，凝膠微球變得致密，體外釋放實驗表明，β-胡蘿卜素從凝膠微球釋放行為遵循Fickian擴散機制的Higuchi模型，在3 h后進入緩慢和持續性釋放階段，β-胡蘿卜素凝膠微球運載體系具有很好的包封和緩釋效果。

(3)由殼聚糖、海藻酸鈉、乳液構建的凝膠微球可實現對β-胡蘿卜素更好的包埋及緩釋。凝膠微球在生物活性物質運載及緩釋領域具有廣闊的應用前景。