藻藍蛋白對四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化及腸道微生物的影響

翟詩翔 ,李文軍 ,李莉莉 ,王 莉,秦 松

(1.中國科學院煙臺海岸帶研究所,山東 煙臺 264003; 2.中國科學院大學,北京 100049; 3.煙臺市奇山醫院,山東 煙臺 264001; 4.中國科學院海洋大科學研究中心,山東 青島 266071)

肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝臟在受到刺激反復或連續損傷時肝臟細胞對這些損傷的修復反應。當長期傷害或炎癥導致肝臟中過多的疤痕組織積聚,就會發生肝纖維化。肝纖維化是所有慢性肝病發展成為肝硬化的必經階段,晚期肝纖維化會發展為肝衰竭甚至肝癌[1]。目前肝臟疾病在世界范圍內發病率和死亡率都很高,這與日益增加的經濟和社會影響有關。而目前缺乏治療肝纖維化的有效療法。

由于肝纖維化的發生涉及多個因素多條通路的參與,肝纖維化的防治也比較困難。目前在肝纖維化的治療上還沒有特效藥,僅有鱉甲軟肝片和扶正化瘀片這兩種中藥被批準用來治療肝纖維化[2]。最近很多研究表明肝臟疾病和腸道微生物相關。腸道和肝臟能通過膽道、門靜脈和體循環進行物質交換。腸道中宿主和微生物的代謝物,能通過門靜脈易位至肝臟,影響肝臟中的膽汁酸合成,葡萄糖和脂質代謝。如芳香族的氨基酸的微生物代謝產物苯乙酸在非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發病進展中起著關鍵的作用[3]。腸道微生物產生的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)也能通過腸屏障,經循環系統進入到肝臟中,激活肝臟巨噬細胞,產生促炎因子,造成肝臟損傷及纖維化[4-5]。因此,腸道微生物的穩態能影響肝臟的健康,臨床上觀察到肝臟疾病患者體內存在腸道微生物失調的多種情況[6]。

藻藍蛋白(phycocyanin,PC)是一種天然的色素蛋白,通常存在于藍藻和紅藻中,目前規模化制備的PC大多來自螺旋藻。近年來的研究證明PC具有抗肺纖維化、保肝和調節腸道菌群的作用[7-10],同時PC還容易得到,安全無毒。PC的這些優良特性表明其可能是一種改善肝纖維化的潛在物質。本文探究了 PC對 CCl4誘導造成的肝纖維化的改善效果及對腸道菌群的影響,解釋了腸道菌群在PC抗纖維化過程中的作用機理。

1 材料

1.1 儀器

7500型實時定量 PCR儀(Applied Biosystems,7500 Fast System),Basic電泳儀(Bio-RAD,Power-Pac Basic),凝膠成像分析系統(Bio-RAD,Chemi-Doc XRS+),正置顯微鏡(Zeiss,Axio Scope.A1),包埋機(Leica,ARCADIA),石蠟切片機(Leica,RM2235)。

1.2 藥物與試劑

本實驗中所用的 PC(產品單號 C-190430,Amax/A280=3.0)購自福清市新大澤螺旋藻有限公司; RNAiso Plus(Total RNA 提取試劑)、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、TB Green?Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus) 購于Takara公司; HE染色試劑盒和Masson染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠21只,體重130～160 g,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,許可證號:SCXK(魯) 2019 0003。飼養于山東國際生物科技園。

2 方法

2.1 實驗動物分組及干預

飼養條件: 溫度 (23±2) ℃,相對濕度(45±10)%,光照周期為12 h光照/12 h黑暗,自由進食和進水。適應性飼喂一周后,以體重為標簽,將 21只大鼠隨機分成3 組,每組7只。分組方式為: 對照組(NC),肝纖維化組(FIB),CCl4+PC干預組(FIB_PC)。CCl4+PC干預組每天灌胃100 mg/kg的PC,對照組灌胃同等體積的蒸餾水,持續4周。用腹腔注射CCl4的方法建立肝纖維化模型,具體方法為: 腹腔注射體積分數為12.5%的CCl4橄欖油溶液,以0.01 mL/g體重每周注射2次,持續4周[11]。

2.2 樣本采集

大鼠的糞便于干預的最后一天采集。將大鼠輕輕抓取起來時大鼠就會排便(若無糞便排出,可用消毒棉簽輕輕刺激大鼠的肛門,即可排便),將剛排出的糞便樣品收集于無菌的凍存管中,然后立即放入液氮中冷凍后,置于-80 ℃ 冰箱進行保存。

2.3 大鼠肝臟組織的HE和Masson染色

腹腔注射質量分數為10%的水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g大鼠),使大鼠進入麻醉狀態后,取肝臟中的最大葉,置于質量分數為 4%的多聚甲醛固定液中固定,在4 ℃冰箱內固定24 h后,按說明書的方法進行HE染色(蘇木精-伊紅染色,hematoxylin and eosin stain)和 Masson染色(又稱馬森三色染色法,masson’s trichrome stain),通過鑒定肝組織中炎性細胞和纖維化的程度來判斷肝纖維化的階段。將剩余的肝臟組織于-80 ℃冰箱中保存,以備后續檢測相關基因的表達。

2.4 RT-PCR檢測大鼠肝臟組織中纖維化標志物的表達

每組取3只大鼠肝組織,用RNAiso Plus試劑提取總 RNA。肝纖維化標志物 I型膠原蛋白(collagen type I,Co-I)和α-平滑肌肌動蛋白(alphasmooth muscle actin,α-SMA)的擴增引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成。序列如下所示:α-SMA_F GCCATCAGGAACCTCGAGAA; α-SMA_R AGCTGTCCTTTTGGCCCATT; Co-I_F GGAGAGA GCATGACCGATGG; Co-I _R GGGACTTCTTGAG GTTGCCA; β-actin_F CGTAAAGACCTCTATGCC AACA; β-actin_R GGAGGAGCAATGATCTTGA TCT。每個樣本設置2個技術平行。PCR反應條件為: 先 95 ℃預變性 30 s,進入循環,循環 40 次,循環條件為 95 ℃變性5 s,60 ℃退火和延伸 30 s。以 β-actin 作為內參,用雙德爾塔 Ct法(2-ΔΔCt)計算目的基因的相對表達量。

2.5 腸道菌群的高通量測序

利用糞便 DNA 提取試劑盒提取大鼠糞便樣本的基因組DNA。以細菌的 16S 核糖體RNA基因的V3—V4 可變區引物(338F 5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′和 806R 5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3′),將所提取的 DNA 樣本進行的 PCR 擴增(ABI GeneAmp?9700型 PCR儀)。2%瓊脂糖電泳檢測擴增樣品,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收 PCR產物,使用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit試劑盒(Illumina公司)構建MiSeq文庫,并根據測序流程利用Illumina MiSeq測序平臺進行測序。

2.6 統計學方法

用IBM SPSS Statistics 22軟件對數據進行統計分析,最終結果以平均值±標準差(±s)呈現,用單因素方差分析檢驗不同組之間的顯著性,用wilcoxon秩和檢驗分析不同組菌群之間的顯著性。P＜0.05表明不同組之間有顯著性差異。

3 結果

3.1 PC對 CCl4誘導大鼠肝纖維化標志物的影響

各組干預后組織中α-SMA和Co-I的mRNA的相對表達量如圖1所示。FIB組肝臟中α-SMA和Co-I的表達量較NC組顯著升高(P＜0.05),而與FIB組相比,FIB_PC組肝臟中α-SMA和Co-I的表達量顯著降低(P＜0.05)。

圖1 PC對α-SMA (a) and Co-I (b)表達的影響Fig.1 Effects of phycocyanin on the liver expression of alpha-smooth muscle actin (α-SMA) (a) and collagen type I (Co-I) (b).

3.2 大鼠肝臟病理分析

用HE染色和 Masson染色評價大鼠的肝損傷程度。HE染色結果顯示,NC組中大鼠的肝臟結構正常,FIB組中出現了大量的嗜酸小體和大量空泡樣變性的肝細胞。FIB_PC組中嗜酸小體和空泡樣變性的肝細胞較 FIB組都有所減輕。Masson染色結果顯示,NC組僅在匯管區存在少量的被染成藍色的膠原纖維,而 FIB組中匯管區周圍存在大量的膠原纖維,且膠原纖維連在了一起,形成了纖維間隔,說明此時大鼠出現了肝纖維化的癥狀。FIB_PC組中雖然匯管區也存在一定量的纖維,但沒有形成纖維間隔,其纖維化程度較 FIB組低(圖2)。結合圖1的結果,表明CCl4誘導4周能造成肝臟纖維化,PC干預具有緩解CCl4造成的肝纖維化的作用。

圖2 各組大鼠肝臟組織染色結果(放大200倍)Fig.2 Pathological section staining of liver tissue (200×)

3.3 腸道微生物基礎質控分析

本次測序21個糞便樣本共產生了1 043 032條有效序列,有效堿基數目為 505 342 145 bp,有效序列的平均長度為 423 bp。各樣本稀釋曲線Shannon指數達到平緩(圖3a),coverage指數達到了95%以上(圖3b),且reads數在35 000以上,說明本次測序的數據量足夠反映出大鼠腸道菌群的組成的真實情況。

3.4 對OTUs的影響

對所得的reads以97% 的相似度進行聚類,共得到 960個操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)(圖3c),NC組有 760個,FIB組有 830個,FIB_PC組有847個,這些組共有的OTUs有639個,NC組獨有38個,FIB組獨有32個,FIB_PC組獨有52個。

圖3 藻藍蛋白干預對腸道微生物組成的影響Fig.3 Phycocyanin intervention modulated composition of gut microbiota

3.5 OTUs聚類分析

對測得的各組腸道微生物進行OTUs聚類分析,非加權 unifrac主坐標分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)的結果如圖3d所示,以 95%的置信區間給圖中各組加上分組橢圓,結果顯示 NC組、FIB組和 FIB_PC組在圖中對應的點分布比較集中,且NC組與FIB組、FIB_PC組的分組橢圓沒有交集,說明PC和CCl4都能改變腸道菌群。與FIB組相比,PC_FIB組的分類橢圓距 NC組遠,可能是因為PC_FIB組是CCl4和 PC雙重干預,且PC是灌胃干預,在消化道中直接與腸道微生物接觸,因此對腸道微生物的影響較大。

在門水平上,將相對豐度小于0.005的門設為其他組,可以看出大鼠腸道內主要的門為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(圖4)。FIB組中,與 NC組相比,CCl4誘導增加了厚壁菌門的相對豐度而減少了擬桿菌門的相對豐度。與FIB組相比,FIB_PC組內Firmicutes與Bacteroidetes的比值降低。

圖4 腸道微生物在門水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of gut microbiota at the phylum level

在科水平上,CCl4誘導降低了擬桿菌科(Bacteroidaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、坦納菌科(Tannerellaceae)等菌群的豐度,PC加入后這些科的細菌相對豐度增加。此外,與 NC組相比,FIB_PC組還顯著增加了消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)的相對豐度(圖5)。

圖5 藻藍蛋白干預在科水平上對腸道微生物豐度的影響Fig.5 Phycocyanin intervention changed the relative abundance of gut microbiota at the family level

在屬水平上,與 NC組相比,FIB組擬桿菌屬(Bacteroides)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、布勞特氏菌屬(Blautia)的相對豐度顯著降低(P＜0.05)。而與FIB組相比,FIB_PC組中別樣棒菌屬(Allobaculum)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等菌的相對豐度顯著增加(圖6)。

圖6 藻藍蛋白在屬水平上對腸道微生物豐度的影響Fig.6 Phycocyanin intervention changed the relative abundance of gut microbiota at the genus level

4 結論和討論

因為CCl4腹腔注射誘導的肝纖維化與真實的化學物質造成的肝損傷類似,所以該肝纖維化模型在實驗室廣泛使用。本實驗中,CCl4誘導的大鼠肝臟組織中肝纖維化標志物α-SMA和Co-I顯著增加,病理檢查發現肝臟出現了纖維化樣病變,說明建模成功。

CCl4能通過多種方式對肝臟造成損傷。CCl4在生物組織中發生碳鍵的斷裂,形成活性三氯甲烷(CCl3·)自由基和三氯甲烷過氧基(CCl3OO·)自由基,這些自由基攻擊肝臟細胞,導致了細胞膜上脂質過氧化,進而引起肝細胞的持續損傷[12]。之前的研究表明PC能夠通過抗氧化作用降低 CCl4誘導的肝損傷。Vadiraja等[13]研究表明,PC能夠清除大鼠肝臟內CCl4產生的自由基,從而降低脂質過氧化和肝損傷。Ou等[7]證明PC可以通過清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)并增強超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性來減少CCl4誘導的肝損傷。此外,PC上的色基藻藍膽素(phycocyanobilin,PCB)能顯著提高 CCl4小鼠血清和肝臟中的SOD水平,降低肝損傷[12]。在本研究中,PC干預降低了 CCl4誘導的大鼠肝臟組織中α-SMA和 Co-I的增加,改善了大鼠肝臟組織的病理狀態,說明PC具有改善肝纖維化的作用。

除了誘導脂質過氧化外,CCl4誘導的肝纖維化還可能與腸道菌群相關。D’Argenio等[14]用 CCl4誘導了大鼠肝纖維化,發現纖維化大鼠存在腸道菌群失調。臨床上也發現了肝硬化患者存在腸菌失調,Qin等[15]通過定量宏基因組學的方法揭示了肝硬化患者和健康人菌群之間的差異,和健康人相比,肝硬化患者腸道中Bacteroidetes的豐度降低,而Firmicutes的豐度升高。Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)可以反映腸道微生物的失調情況。本研究發現大鼠糞便中主要的菌門為Firmicutes和Bacteroidetes,這2個菌門占據大鼠總微生物的 90%以上,數量上涵蓋了大部分的腸道細菌。CCl4誘導增加了Firmicutes的豐度,降低了 Bacteroidetes的豐度,說明 CCl4誘導了大鼠的腸道菌群的失調,而PC抑制了CCl4造成的Bacteroidetes的豐度降低和Firmicutes的豐度升高,說明PC能夠改善 CCl4引起的腸道微生物的紊亂,這種改善可能有助于PC緩解肝纖維化。

本研究中CCl4干預降低了Bacteroides、Parabacteroides、Blautia等的豐度,這些菌都能產生短鏈脂肪酸[16-20]。腸道中短鏈脂肪酸具有抗炎作用,短鏈脂肪酸減少會增加機體的炎癥反應[21]。之前的研究觀察到自身免疫性肝炎中Parabacteroides的豐度降低[22],非酒精性脂肪肝患者和纖維化患者體內Blautia菌顯著降低[23],Yan等人[24]觀察到 CCl4處理后大鼠腸道中Bacteroides豐度下降,D’argenio 等[14]發現 CCl4誘導的肝纖維化大鼠體內腸道菌群發生了紊亂,促炎細胞因子水平升高。說明CCl4或許可以通過降低短鏈脂肪酸產生菌的豐度,增加機體炎癥,促進肝纖維化的發展。PC干預增加了腸道中益生菌Blautia的豐度。Blautia能夠調節免疫反應,從而發揮抗炎活性,能改善肝硬化患者的預后[25]。因此,我們推測PC能夠通過調節腸道菌群調節免疫反應,從而降低肝臟的炎癥水平,緩解肝臟纖維化。

PC對 CCl4誘導的肝纖維化具有良好的改善作用。本文首次比較了 PC 干預對 CCl4誘導的肝纖維化大鼠腸道微生物組成與結構的影響。結果表明了PC能夠增加大鼠體內具有抗炎活性的益生菌的豐度,降低肝纖維化標志物的表達水平,具有緩解 CCl4誘導的肝纖維化的潛力。但PC在消化道中的代謝及其與機體和腸道微生物相互作用的機理較為復雜,是PC通過腸道微生物影響肝纖維化,還是 PC通過減弱肝纖維化,進一步影響腸道菌群,還需要通過糞菌移植等試驗進行驗證。