基于PC型EPA含量評價南極磷蝦油產品

范雁，楊淼，姜君鵬，馮迪娜，薛松

（1.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023；2.中國科學院大學，北京 100049；3.大連理工大學生物工程學院，遼寧 大連 116024）

南極磷蝦是南極海洋中主要的磷蝦種類，近年來，磷蝦的營養保健功能已被廣泛報道[1-3]，其獨特的營養成分使得人們對磷蝦產品研發的興趣日益增加。極性脂和甘油三酯(tiglyceride，TAG)是南極磷蝦的主要脂質組分，分別占其總脂含量的56%～81%和12%～38%[4]。南極磷蝦油是從整個南極磷蝦或磷蝦粉獲得的脂質提取物，磷蝦油中磷脂（phospholipid，PL）占總脂含量的40%以上[5]，這與植物食用油以TAG（＞95%）為主要脂質組分不同。南極磷蝦油富含ω-3型多不飽和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFA），特別是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。研究表明，EPA和DHA作為重要的功能性脂肪酸能改善人類的大腦功能[6]、降低心血管風險[7]和減少慢性炎癥[8]等。磷蝦中的EPA和DHA主要以磷脂形式存在[9-10]，而魚類中的ω-3 PUFA主要以TAG形式存在。研究表明，相比于TAG型EPA和DHA，PL型EPA和DHA能夠更好地滲入組織中，具有更強的心臟保護作用[11]和生物活性[12]。隨著消費者對高品質磷蝦油的需求量不斷增加，市場上出現的許多品牌的南極磷蝦油，品質差異較大[13]。為了磷蝦油產業的健康發展，要健全其產品的過程控制及質量的評價體系。目前EPA和DHA含量為磷蝦油品質評價指標之一[14]，通過在磷蝦油產品中添加魚油可提高EPA和DHA含量。因此建立更準確地評價磷蝦油產品方法對于磷蝦油產品市場健康發展具有重要意義[15-16]。

基于內標十七烷酸甲酯（methyl heptadecanoate，C17:0-ME）的EPA定量分析方法，通過薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）分離，采用氣相色譜法定量分析南極磷蝦油卵磷脂（lecithin，PC）型EPA的含量，提出南極磷蝦油PC型EPA占總EPA比例的評價指標，這一指標可以有效定量EPA的單一存在形式，甄別出含有外源添加EPA的南極磷蝦油，本文利用該指標分析了6種不同來源南極磷蝦油的品質，為南極磷蝦產品的質量控制評價提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

正己烷（色譜純）：德國Merck公司；氯仿、甲醇、三乙胺、丙酮（分析純）：天津科密歐有限公司；二十碳五烯酸甲酯（methyl eicosapentaenoate，EPA-ME）標準品（純度≥98.5%）、C17:0-ME標準品（純度≥99%）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）標準品（純度≥99%）、PC標準品（純度≥99%）：美國SIGMA公司。

1.2 南極磷蝦油樣品

南極磷蝦油樣品及廠家見表1。

表1 南極磷蝦油樣品及其廠家Table 1 Antarctic krill oil samples and manufacturers

1.3 儀器與設備

7890B型氣相色譜儀（附氫火焰離子化檢測器）：美國Agilent公司；BS210S分析天平：德國Sartorius公司；Silica gel 60 F254硅膠板（0.20 mm，20 cm×20 cm）：德國Merck公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 標準品溶液的配制

EPA-ME標準溶液：用正己烷分別配制成濃度為 0.20、0.23、0.29、0.33、0.39 mg/mL；C17:0-ME 標準溶液：用正己烷分別配制成濃度為 0.04、0.19、0.38、0.57、0.76 mg/mL，現配現用。

1.4.2 南極磷蝦油樣品轉酯化

稱量南極磷蝦油樣品至10 mL圓底燒瓶中，加入5 mL 2%的H2SO4-甲醇，70℃油浴反應1 h。反應結束后冷卻至室溫（25℃），向燒瓶中加入2 mL正己烷和0.75 mL蒸餾水，混合30 s[17]。取上層有機相進行氣相色譜分析[18]。

1.4.3 氣相色譜檢測條件

色譜柱：DB-23色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），色譜柱升溫程序：130℃保持1 min；130℃～170℃，10℃/min；170℃～215℃，2.8℃/min保持 1 min。進樣口溫度：270℃，氫火焰離子化檢測器溫度：270℃，進樣方式：分流進樣，分流比 10∶1，進樣量：1 μL，載氣：高純氮氣（99.99%）。

1.4.4 校正因子的計算

分別讀取EPA-ME和C17:0-ME（內標）峰面積，按下式計算校正因子。

式中：f為校正因子；A內標為內標C17:0-ME峰面積；A標準品為 EPA-ME 峰面積；M內標為內標 C17:0-ME質量，mg；M標準品為 EPA-ME 的質量，mg。

1.4.5 南極磷蝦油中EPA含量的測定

采用校正的內標法對EPA進行定量，EPA的含量（xi）計算公式如下。

式中：Ai為EPA的峰面積；A內標為內標C17:0-ME的峰面積；Mi為所稱取南極磷蝦油的準確質量，mg；M內標為內標 C17:0-ME 質量，mg。

1.4.6 PC型EPA含量的定量分析

稱取等質量的南極磷蝦油樣品，用氯仿溶解點于硅膠板上，展開劑采用氯仿∶甲醇∶水∶三乙胺（50∶40∶8∶50，體積比）[19]。待溶劑完全揮發后，利用濃度0.05%（溶劑為20%水和80%丙酮）櫻草黃噴霧顯色，紫外燈365 nm下觀察。將PC條帶刮下，按照1.4.2和1.4.3進行轉酯化和氣相色譜分析。

1.5 統計分析

試驗數據采用SPSS 18.0進行統計分析，結果以平均值±標準偏差表示（n=3），利用單因素方差分析（ANOVA）對不同南極磷蝦油產品品質的差異顯著性進行統計分析，當差異顯著時，對數據進行Turkey多重比較分析，以P＜0.05作為差異顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 基于C17:0-ME內標法的EPA定量分析

C17:0-ME、EPA-ME標準品及不同來源南極磷蝦油樣品的氣相色譜圖見圖1。

圖1 C17:0-ME、EPA-ME標準品及不同來源南極磷蝦油樣品的氣相色譜圖Fig.1 The gas chromatograph of EPA-ME,C17:0-ME standards and Antarctic krill oil samples from different sources

由圖1可知，EPA-ME和C17:0-ME標準品的保留時間分別為14.9、7.5min，兩種脂肪酸甲酯完全分離。此外，南極磷蝦油樣品4的EPA-ME的保留時間為14.9min，樣品5～9的EPA-ME的保留時間為15.8min。從氣相色譜分析圖中可以定性比較不同來源南極磷蝦油樣品PC型EPA的含量，圖1顯示，樣品6和樣品7的PC型EPA的含量較高，樣品5和9次之，樣品4和8較低。

不同濃度EPA-ME對內標C17:0-ME的相對質量校正因子見表2。

表2 EPA-ME對內標C17:0-ME的相對質量校正因子Table 2 The relative mass correction factor of EPA-ME in relative to the internal standard C17:0-ME

由表2可知，C17:0-ME濃度的線性范圍為0.04 mg/mL～0.76 mg/mL，在該范圍內得到EPA-ME對C17:0-ME的相對質量校正因子為1.52。

2.2 南極磷蝦油PC型EPA的定量分析及PC型EPA含量占總EPA含量比例的確定

磷脂標準品和樣品1～3的磷脂分離見圖2。

圖2 磷脂標準品和南極磷蝦油磷脂的分離Fig.2 Separation of phospholipid standard and Antarctic krill oil phospholipid

由圖2可知，南極磷蝦油的PL主要包括PC、溶血磷脂酰膽堿（lysolecithin，LPC）和PE，而PC和LPC是南極磷蝦油的主要組分，本研究測定的PC組分是分離的PC和LPC含量之和。

基于C17:0-ME對EPA-ME的相對質量校正因子計算得到南極磷蝦油樣品1～3的PC型EPA的含量，具體見表3。

表3 南極磷蝦油樣品1～3的品質分析Table 3 Quality evaluation of Antarctic krill oils samples 1-3

從TLC中獲得的PC組分，由于量非常少，大約為0.5 mg～1 mg，用稱重法難以進行準確定量。因此，將TLC分離得到的樣品PC經轉酯化進行了脂肪酸甲酯的定量分析。比較樣品1和2的總EPA含量以及PC型EPA的含量，總EPA含量均為南極磷蝦油質量的10%以上，樣品1中的總EPA含量比樣品2高27%。從總EPA含量來分析兩個樣品的品質，樣品1優于樣品2。通過對其PC型EPA的含量進行測定，結果顯示，樣品1的PC型EPA含量約為樣品2的2倍，結合總EPA的含量，計算得到兩個樣品PC型EPA占總EPA含量的比例，均大于50%，且樣品1比樣品2高27%。從這一參數分析兩個樣品的品質，得到的結論與通過總EPA含量分析得到的結果一致，說明PC型EPA含量占總EPA含量比例這一參數可以作為分析不同來源南極磷蝦油品質的指標，且能夠準確定量南極磷蝦油樣品中的PC型EPA含量。此外，樣品3所含PC型EPA含量占總EPA含量比例高達85%左右。雖然樣品1和2的PC型EPA含量占總EPA含量的比例達到了50%以上，但其品質還能夠通過工藝優化進一步提高。

按照1.4.5和1.4.6方法計算不同來源南極磷蝦油（樣品4～9）PC型EPA含量占總EPA含量的比例，結果見表4。

表4 不同來源南極磷蝦油（樣品4～9）品質的比較Table 4 Comparison of the quality of Antarctic krill oil samples（4-9）from different sources

從測定結果分析，樣品5和6的總EPA含量無顯著差異，但樣品6中PC型EPA含量占總EPA含量的比例顯著高于樣品5，且樣品6中PC型EPA含量是非PC型EPA含量的2倍左右，綜合總EPA含量的數據和PC型EPA/總EPA含量數據，說明了樣品6中EPA的存在形式主要是PC型。比較樣品5和8，樣品5的總EPA含量約為樣品8的2倍，但兩個樣品PC型EPA含量占總EPA含量的比例無顯著差異，同時樣品5和樣品8的PC型EPA含量與非PC型EPA含量的比值相當，說明兩個樣品的EPA存在形式是一致的。

樣品9的總EPA含量達到17.9%，均高于其它5種南極磷蝦油，但其PC型EPA含量占總EPA含量的比例只有29.7%，均低于其它5種南極磷蝦油，表明該樣品的EPA主要以非磷脂型EPA形式存在，如TAG型或游離型EPA。因此南極磷蝦油中總EPA含量不能反映EPA的存在形式，而PC型EPA含量占總EPA含量的比例能夠對南極磷蝦油EPA的存在形式進行準確的表征，區別出含有外加非磷脂型EPA的蝦油。PC型EPA含量占總EPA含量的比例作為過程控制參數，也可以表征磷脂的水解情況。

根據這一參數分析本研究中這6種南極磷蝦油樣品的品質，較優的為樣品6和樣品7，PC型EPA含量占總EPA含量的比例均在60%以上；其次為樣品4、5、8。這5種樣品PC型EPA含量占總EPA含量的比例在48%～70%之間；而樣品9的該參數顯著低于其它5種樣品，以此為標準可以鑒定不同南極磷蝦油產品的品質。

3 結論

本研究建立了基于C17:0-ME內標法準確測定EPA的定量方法，測定得到的EPA-ME相比于C17:0-ME的相對質量校正因子為1.52。結合TLC分離定量分析了南極磷蝦油PC型EPA的含量，提出了PC型EPA含量占總EPA含量的比例這一南極磷蝦油品質評價指標，根據這一參數分析了6種不同來源南極磷蝦油的品質，并篩選出優質南極磷蝦油（樣品6和樣品7），其PC型EPA含量占總EPA含量的比例在60%以上，最高可達70%，這些結果為南極磷蝦油產品質量標準評價體系的建立提供科學依據。