重癥手足口病患兒血清ACTB、SAA表達變化及臨床意義

馮 娜，謝坤霞，劉 慶

近年來，手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）一直在世界范圍內傳播，主要在5歲以下人群中暴發，該疾病已成為兒童保健的主要關注點之一[1]。Cox A16和EV 71被認為是導致HFMD的主要病原體，且EV 71感染與HFMD高發病率和高病死率有關[2]。為了預防和控制可能的HFMD大流行，提高HFMD的診斷準確性至關重要[3]。人β-肌動蛋白（β-actin,ACTB）是腦微血管內皮細胞細胞骨架蛋白的重要組成成分，質量約為42 KDa，基本上存在于所有真核細胞中，目前多將其作為內參基因進行研究，發現其在多種癌癥中表達失調[4]。血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A,SAA）屬于載脂蛋白，因其是淀粉樣變中主要組成成分淀粉樣A蛋白的血清前體而得名，是一組多型性蛋白。近年來研究發現SAA是一種急性時相蛋白，在感染、創傷等應激狀況下于6～36 h內迅速升高，并隨疾病恢復迅速下降，在感染、創傷、心腦血管疾病中受到越來越多研究者的關注[5]。本研究旨在通過探究重癥HFMD患兒血清ACTB、SAA的表達變化及其臨床意義，為重癥HFMD的臨床診斷提供一定參考。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2019年2月—2020年2月于延安大學附屬醫院接受治療的重癥HFMD患兒42例作為試驗組，其中男27例，女15例，年齡2～4歲，平均年齡（2.82±0.16）歲。選取同期在我院體檢的健康兒童42例作為對照組，其中男25例，女17例，年齡2～4歲，平均年齡（2.73±0.14）歲。2組在性別與年齡方面差異均無統計學意義（χ2=0.202，P=0.653；t=2.743，P=0.007）。

HFMD患兒診斷標準符合《手足口病診療指南（2018年版）》[6]。納入標準：①符合重癥HFMD診斷標準的患兒；②病程1～2 d。③患兒家屬知情并簽署同意書。排除標準：①患有其他急性感染、慢性炎癥性疾病（如單純皰疹病毒感染、巨細胞病毒感染引起的腦炎）；②患有口蹄疫、皰疹性咽喉炎、風疹、水痘等；③患有自身免疫缺陷性疾病（如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等）。本研究經我院道德倫理委員會批準通過（倫理批號：20151208），符合世界醫學協會《赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑和儀器 低溫高速離心機（美國Thermo Scientific公司）；人ACTB ELISA試劑盒（美國Cusabio Biotech公司，貨號：CSB-E13298h）；人SAA ELISA試劑盒（美國Cusabio Biotech公司，貨號：CSB-E08589h）； CRP試劑盒（無錫市申瑞生物制品有限公司）；-80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集研究對象清晨空腹肘靜脈血5 ml，靜置30 min，室溫3000 rpm，離心15 min，吸取上清液分別裝入EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存備用。同時留取清晨尿液樣本。

1.3.2 樣本檢測 實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測研究對象血清中病原體Cox A16、EV 71，免疫層析法定量測定CRP水平，ELISA法檢測血清中ACTB、SAA表達水平，嚴格按照試劑盒說明書進行。全自動生化分析儀檢測尿液，項目包括：AST、LDH、CK、CK-MB、BUN、CRE和尿視黃醇結合蛋白（retinol blinding protein,RBP）含量。

1.4 統計學處理 利用SPSS 22.0進行統計學分析，計數資料采用例（%）表示；計量資料符合正態分布，以±s表示，行獨立樣本t檢驗。Pearson法分析血清ACTB、SAA水平的相關性。二元Logistic回歸分析發生重癥HFMD患兒的影響因素。ROC曲線分析血清ACTB、SAA表達水平對重癥HFMD的診斷效能。P＜0.05時，表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料比較 與對照組相比，試驗組患兒的LDH、AST、CK、CK-MB、BUN及RBP水平均升高（P均＜0.05）（表1），并出現發熱、皮疹癥狀。試驗組中22例（52.38%）出現嗜睡、10例（23.81%）出現驚厥、8例（19.05%）出現頭痛、6例（14.29%）出現躁動；31例（73.81%）CRP＞8 mg/L；Cox A16陽性11例（26.19%），EV 71陽性31例（73.81%）。

表1 2組心肌酶譜及腎功能比較（±s）Table 1 Comparison of myocardial enzyme spectrum and renal function between 2 groups(±s)

表1 2組心肌酶譜及腎功能比較（±s）Table 1 Comparison of myocardial enzyme spectrum and renal function between 2 groups(±s)

指標 對照組(n=42)試驗組(n=42) t值 P值LDH(U/L) 182.63±16.74 268.41±70.51 7.671 0.000 AST(U/L) 25.93±5.26 35.65±10.36 5.422 0.000 CK(U/L) 48.35±10.57 96.48±35.87 8.341 0.000 CK-MB(U/L) 17.58±5.13 27.95±8.26 6.912 0.000 BUN(mmol/L) 3.42±0.75 3.93±0.97 2.696 0.002 CRE(μmol/L) 36.69±7.35 37.85±8.57 0.666 0.507 RBP(mg/L) 178.53±60.34 985.46±346.73 14.859 0.000

2.2 2組血清ACTB、SAA水平比較 與對照組比較，試驗組患兒血清ACTB、SAA表達水平均升高，差異均具有統計學意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 2組血清ACTB、SAA水平比較（±s）Table 2 Comparison of ACTB and SAA levels between 2 groups(±s)

表2 2組血清ACTB、SAA水平比較（±s）Table 2 Comparison of ACTB and SAA levels between 2 groups(±s)

組別 ACTB (ng/ml) SAA (ng/ml)對照組 1.32±0.21 6.81±0.35試驗組 4.36±0.71 30.57±5.36 t值 26.609 28.667 P值 0.000 0.000

2.3 試驗組血清ACTB、SAA水平相關性分析 Pearson分析結果顯示，重癥HFMD患兒血清ACTB、SAA表達水平呈正相關（r=0.565，P=0.000）。見圖1。

圖1 試驗組血清ACTB、SAA水平相關性Figure 1 Correlation of serum ACTB and SAA levels in experimental group

2.4 發生重癥HFMD的獨立危險因素分析 以是否發生重癥HFMD為因變量，以ACTB、SAA為自變量，進行二元Logistic回歸分析，結果顯示，血清ACTB、SAA水平偏高均是發生重癥HFMD的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 發生重癥HFMD的二元Logistic回歸分析Table 3 Binary Logistic regression analysis of severe HFMD

2.5 血清ACTB、SAA單項、聯合診斷重癥HFMD的效能 ROC曲線分析顯示，ACTB預測重癥HFMD的AUC為0.827（95%CI：0.705～0.942），截斷值為3.01 ng/ml，敏感度為62.7%，特異度為93.3%；SAA預測重癥HFMD的AUC為0.836（95%CI：0.735～0.953），截斷值為26.41 ng/ml，敏感度為70.1%，特異度為90.4%；2者聯合檢測重癥HFMD的AUC為0.862（95%CI：0.812～0.969），敏感度為75.2%，特異度為91.6%。見圖2。

圖2 血清ACTB、SAA水平對重癥HFMD的診斷效能Figure 2 Diagnostic efficiency of serum ACTB and SAA levels in severe HFMD

3 討 論

HFMD是兒童常見疾病，伴隨發熱、厭食、乏力、精神萎靡，手、足、口腔等部位出現皮疹、皰疹或潰瘍等全身癥狀。多數情況下HFMD患兒病情較輕，1周內可痊愈，但少數患兒會出現中樞神經系統并發癥或神經源性肺水腫和肺出血，甚至出現腦干腦炎、腦膜炎、急性遲緩性麻痹、心肌損傷等嚴重并發癥[8]。重癥HFMD患兒具有較高致死率和致殘率[9]。研究發現，對HFMD患兒檢測血清心肌酶譜水平，有助于了解病變嚴重程度，為臨床治療提供依據[10]。BUN及RBP是腎功能損傷的敏感標志物，張銀仙等[11]發現早期腎損傷患者血清BUN、RBP水平高于健康者，在早期腎損傷的診斷中具有較高價值。本研究發現，與對照組相比，試驗組LDH、AST、CK等心肌酶譜及腎功能相關指標BUN、RBP水平均升高，表明患兒出現不同程度心肌及腎損害，為臨床治療重癥HFMD提供參考。

為更好預防HFMD患兒發展為重癥病例，臨床需尋找有效生物指標進行早期診斷防治。張亞萍等[13]研究發現ACTB在急性腦梗死患者超早期血液里表達升高，可作為一種診斷急性腦梗死的血清標志物。人體內SAA主要有肝臟細胞合成，是急性應激階段最敏感的蛋白質之一，人脂肪細胞、血管內皮細胞分泌SAA，引起巨噬細胞水平上升并反映炎癥水平。趙昕峰等[14]研究發現，SAA聯合CRP檢測HFMD，有助于提高早期的診斷效率，SAA可為兒童HFMD的輔助診斷提供有用的參考信息。本研究發現，與對照組相比，試驗組患兒血清ACTB、SAA表達水平均升高。提示ACTB、SAA表達水平可能與HFMD的發生有關，與Zhou等[15]的研究結論相一致。Pearson分析結果顯示，重癥HFMD患兒血清ACTB、SAA表達水平呈正相關，提示2者可能共同參與重癥HFMD的發生、發展過程。二元Logistic回歸分析結果顯示，血清ACTB、SAA水平偏高是發生重癥HFMD的獨立危險因素。ROC分析顯示，ACTB、SAA的截斷值分別為3.01 ng/ml、26.41 ng/ml，且2項聯合檢測診斷重癥HFMD的效能優于單項檢測。提示ACTB及SAA 2者均具有較高的臨床診斷效能，臨床可密切監測指標變化，從而為診斷重癥HFMD提供可靠依據。

另外，試驗組Cox A16陽性11例，EV 71陽性31例，表明患兒主要感染病原體為EV 71（73.81%），但相對于鄧坤儀等[12]調查的中山市62.59%的EV 71陽性率較高，這可能與調查地區及樣本例數有關，對于HFMD基本臨床特征可在后期擴大范圍深入分析。

綜上所述，重癥HFMD患兒血清ACTB、SAA表達水平均顯著升高，且2者呈正相關，聯合檢測對重癥HFMD的診斷具有較高效能，可為臨床診斷重癥HFMD提供一定參考。本研究存在研究人數偏少、未進一步對比不同病情嚴重程度患兒ACTB、SAA水平差異等問題，重癥HFMD患兒血清中其他因子與ACTB、SAA的相互作用、具體作用機制及聯合檢測的價值有待進一步研究。