一種茶樹新害蟲
——貢山喙薊馬Mycterothrips gongshanensis 的鑒定

李 帥，孟澤洪*，呂召云，修春麗，張金峰，楊 文，周玉鋒

1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；2. 山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺 264002；

3. 中國農(nóng)業(yè)科學院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008；4. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術研究所，貴州 貴陽 550006

害蟲為害是影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因子之一。近40年來，我國茶園害蟲的發(fā)生經(jīng)歷了由鱗翅目食葉類害蟲向小型刺吸式害蟲演替和由發(fā)生代數(shù)少的種類向發(fā)生代數(shù)多的種類演替的過程，茶樹吸汁性害蟲的防治將成為未來的研究重點[1]。薊馬是一類重要的茶樹吸汁性害蟲，通常以成蟲和若蟲銼吸茶樹嫩梢嫩葉，導致被害葉片褐化、葉質(zhì)僵脆、萎縮卷曲甚至枯焦、脫落，一年可發(fā)生10余代，嚴重影響茶葉生產(chǎn)[2-3]。在我國，已報道的茶樹薊馬種類有20余種[4-7]，其中，以茶黃硬薊馬Scirtothrips dorsalis Hood和茶棍薊馬Dendrothrips minowai Priesner危害最為嚴重。茶黃硬薊馬是我國南方茶區(qū)重要害蟲之一[8]，自上世紀八十年代起便嚴重影響廣東、廣西、湖南、江西等地的茶葉生產(chǎn)[9]；2006年，福建省華安縣茶黃薊馬曾大面積發(fā)生，受害茶園一般減產(chǎn)7.1% ～ 9.6%，嚴重的達18.7%[10]。茶棍薊馬在我國以貴州發(fā)生最為嚴重，時有茶場暴發(fā)成災，產(chǎn)量損失在50%，甚至60%以上[11-12]，近年來更是發(fā)生了種群擴張[13]，在浙江、江西、江蘇、湖北等省亦發(fā)現(xiàn)有嚴重為害[1]。此外，如褐三鬃薊馬Lefroyothrips 1efroyi[3]、花薊馬 Frankliniella intonsa[14]、華簡管薊馬Haplothrips chinensis[15]等種類雖常見于各地茶園，但鮮有嚴重危害的報道。

自2014年以來，我們在貴州發(fā)現(xiàn)一種嚴重影響夏秋茶生產(chǎn)的薊馬類害蟲，在貴州有20余個縣市發(fā)生，并在多地茶園暴發(fā)成災，造成葉片脫落，芽梢光禿。由于該薊馬的為害習性特殊：喜藏匿于芽葉間隙內(nèi)為害，受害葉片葉尖均勻褐化變硬等，其形態(tài)特征亦與國內(nèi)已報道的常見茶樹薊馬種類均不相同，曾將其初步鑒定為毛腹喙薊馬Mycterothrips setiventris Bagnall[16]。但在詳細的形態(tài)特征比對之后，本文將該薊馬準確鑒定為與毛腹喙薊馬極為近似的同屬另外一種，即貢山喙薊馬M. gongshanensis Li, Li &Zhang。從發(fā)生程度和為害性上看貢山喙薊馬已成為貴州一種重要的茶樹吸汁性害蟲；此外，在云南保山[4]和西雙版納等地該薊馬亦有被發(fā)現(xiàn)，說明其有較強的環(huán)境適應性。鑒于此，本文首次記錄該種薊馬全蟲態(tài)形態(tài)特征，同時通過實驗獲取了該薊馬線粒體COI基因的分子數(shù)據(jù)（DNA條形碼），為該害蟲的準確鑒定和遺傳多樣性研究提供參考，以便對其進行精準防控。

1 材料與方法

1.1 形態(tài)觀察與鑒定

1.1.1 活體標本顯微觀察

活體標本采自于貴州省惠水縣長巖村云頂茶業(yè)基地（26°9’0”N，106°43’11”E），采集時，用剪刀剪取被貢山喙薊馬為害過的茶樹芽頭（一芽一葉）置于保鮮盒內(nèi)，帶回室內(nèi)飼養(yǎng)觀察。

成蟲觀察：用自制吸蟲器吸取成蟲標本于培養(yǎng)皿內(nèi)進行觀察。由于貢山喙薊馬對光照有強烈的逃避反應，觀察前先將活體標本置于-20℃冰箱冷凍麻痹3 min，取出后立刻置于基恩士VHX-5000超景深三維顯微系統(tǒng)下進行觀察、記錄、拍照和測量。

卵的觀察：用尖頭鑷子輕輕將外層芽葉剝開，并沿中脈將芽葉剪成兩半，找到卵粒準確位置，用解剖刀從卵粒附近劃開至葉片邊緣，用兩把尖頭鑷子沿劃痕輕輕將包裹卵粒的那部分葉肉組織撕開，取出完整卵粒置于基恩士VHX-5000超景深三維顯微系統(tǒng)下進行觀察、記錄、拍照及測量。

若蟲觀察：將采集回來的芽葉挑除全部成、若蟲后進行培養(yǎng)，每日觀察2次，待1齡若蟲孵化后開始單頭飼養(yǎng)并拍照記錄，每次蛻皮后（即2齡、3齡、4齡）均置于基恩士VHX-5000超景深三維顯微系統(tǒng)下進行觀察、記錄、拍照和測量。

1.1.2 玻片標本顯微觀察

參照張宏瑞等[17]的方法，標本制作前先進行浸解（10%氫氧化鈉溶液浸泡24 h），之后用超純水沖洗多次以清除蟲體內(nèi)容物，再置于30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%和100%乙醇溶液中進行逐級脫水，脫水后的薊馬轉(zhuǎn)移至丁香油中進行軟化，用解剖針挑取軟化好的薊馬標本放入滴有二甲苯的載玻片上于解剖鏡下進行整姿，注意蓋片后若仍有氣泡，可在酒精燈或小太陽取暖器上加熱趕出氣泡，以中性樹膠封片。玻片標本置于Nikon DSRi2顯微成像系統(tǒng)下進行拍照，記錄。

1.2 DNA條形碼研究

1.2.1 標本采集

用于分子鑒定的所有標本均為成蟲，采集信息見表1。于茶園中，利用自制吸蟲器吸取薊馬活體標本，并轉(zhuǎn)移至盛有75%乙醇溶液的封凍管中帶回室內(nèi)，于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 標本采集信息Table1 Specimen collection information

1.2.2 DNA提取、PCR擴增與測序

1.5.2 各種植入性輸液泵和留置導管，為非鐵磁性或弱磁性，進行MRI檢查通常是安全的。攜帶胰島素泵進行MRI檢查，可破壞胰島素泵功能，故檢查前要移除胰島素泵。

參照張利娟等[18]基因組DNA的提取方法對單頭薊馬樣本提取DNA。對COI基因DNA條形碼標準片段進行PCR擴增，引物序列為通用引物[19-20]。引物序列：

LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAG ATATTGG-3'

HC02198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAA AAAATCA-3'

PCR擴增體系：10×PCR緩沖液 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，2.5 mmol/L dNTP 混 合液 4 μL，10 μmol/L 的 引 物 各 1.5 μL，5 U/μL的TaKaRa TaqDNA聚合酶0.3 μL，模板DNA 2 μL，加 dd H2O至50 μL。反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性0.5 min，50℃退火45 s，72℃延伸1 min；30輪循環(huán)； 72℃再延伸5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送上海英濰捷基生物技術有限公司純化后進行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

序列的拼接和相似度分析使用DNAMAN軟件進行，結(jié)合測序峰值圖進行正反鏈的拼接校對，將拼接好的序列在BOLD SYSTEM系統(tǒng)中進行序列同源性搜索，以明確已測定序列是否為目標序列片段。采用Mega7軟件[21]計算和分析遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲體鑒定結(jié)果

鑒定主要參考《中國經(jīng)濟昆蟲志第55冊：纓翅目》[22]、Masumoto & Okajima[23]以及Li等[4]對喙薊馬屬Mycterothrips的修訂與研究，通過形態(tài)特征觀察、模式標本核對，本文鑒定該薊馬種類為貢山喙薊馬Mycterothrips gongshanensis（Li, Li & Zhang），其形態(tài)特征和種類鑒定結(jié)果記錄如下：

貢山喙薊馬（Mycterothrips gongshanensisLi,Li & Zhang, 2017）。雌蟲體長1.1 ～ 1.3 mm。體棕褐色至黑褐色；前翅暗褐色，基部和端部色淡（圖2-G）。頭部眼后有橫紋，單眼前鬃略短于單眼側(cè)鬃，單眼間鬃位于后單眼前內(nèi)緣，長度超過前單眼側(cè)鬃的2倍（圖1-D）；觸角8節(jié)，節(jié)I具有1對背頂鬃，節(jié)III和節(jié)IV具有叉狀感覺錐（圖1-A）；前胸背板寬大于長，具有2對長的后角鬃，后緣鬃2對且內(nèi)鬃I稍長于內(nèi)鬃II（圖1-D）；中胸背板具橫紋，前緣感覺孔存在（圖1-E）；后胸背板前中部具橫紋，兩側(cè)具縱紋，中對鬃位于前緣上，無感覺孔（圖1-E）；中、后胸內(nèi)叉骨均具有明顯的刺（圖1-I）；前翅前脈鬃具有長的間斷，端鬃2根，后脈鬃完整，翅瓣鬃5+1根；腹部背板節(jié)II ～ VIII兩側(cè)具橫紋，橫紋上有大量微毛，節(jié)VIII具有完整的后緣梳，腹部腹板無附屬鬃，節(jié)II具有2對后緣鬃，節(jié)III ～ VII具有3對后緣鬃，節(jié)VII后緣鬃位于后緣之前（圖1-F、圖1-G、圖1-K）。

雄蟲體長0.9 ～ 1.1 mm。體色較雌蟲淡（圖2-H）；觸角第6節(jié)幾乎與雌蟲等長（圖1-A、圖1-B）；腹部背板節(jié)VIII具有完整的后緣梳，節(jié)IX具有1對感覺孔和2對深色的刺狀鬃（圖1-H）；腹板節(jié)II無附屬鬃，節(jié)III ～ VIII有8根附屬鬃（圖1-L）。

圖1 貢山喙薊馬玻片標本形態(tài)圖Figure 1 Morphological characteristics of slide specimen of M. gongshanensis

觀察標本：8♀♀2♂♂，貴州貴陽黔中茶園，2014. X. 28，呂召云采；14♀♀4♂♂，貴州貴陽黔中茶園，2015. III. 15，呂召云、孟澤洪采；32♀♀8♂♂，貴州惠水長巖，2018. VII.30，孟澤洪、楊春、周玉鋒采；1♀1♂，貴州惠水長巖，2019. IV. 22，李帥采；6♀♀1♂，貴州水城龍場鎮(zhèn)，2019. IX. 4，李帥采；8♀♀2♂♂，貴州水城順場鄉(xiāng)，2019. IX. 4，李帥采；12♀♀3♂♂，貴州六枝，2019. IX. 6，李帥采；18♀♀2♂♂，貴州興義天沁茶葉基地，2019. IX. 15，李帥采。

2.2 各蟲態(tài)特征

卵（圖2-A、圖2-B）：乳白色，半透明，腎形，長 201 ～ 282 μm，寬 99 ～ 118 μm，近孵化時出現(xiàn)2個紅色眼點。

1齡若蟲（圖2-C）：初孵時乳白色，后轉(zhuǎn)為淡黃綠色，長354 ～ 607 μm，寬119 ～ 140 μm，頭部長37 ～ 65 μm，觸角向前平伸，無翅芽。

2齡若蟲（圖2-D）：黃綠色，長708 ～1016 μm， 寬 171 ～ 199 μm， 頭 部 長 65 ～ 92 μm，觸角向前平伸，無翅芽。

3齡若蟲（偽蛹）（圖2-E）：頭胸部黃白色，腹部黃色，足和觸角白色透明，體長731 ～911 μm，寬 165 ～ 265 μm，頭部長 62 ～ 92 μm，翅芽開始顯露，筒狀，無毛，后翅長于前翅，觸角直立或向后貼于頭部背面。

4齡若蟲（蛹）（圖2-F）：最初通體黃白色，足、觸角、翅白色透明，體長787 ～ 1120 μm，寬 224 ～ 287 μm，頭部長 79 ～ 102 μm，翅芽逐漸伸長并顯露毛序，前翅和后翅幾近等長，觸角向后貼于頭部背面，隨著生長發(fā)育的進程，翅與觸角顏色先變暗，逐漸全體變棕褐色。

圖2 貢山喙薊馬全蟲態(tài)特征圖Figure 2 The whole insect stages morphology of M. gongshanensis

2.3 線粒體COI序列

貢山喙薊馬M. gongshanensis所測雙向序列經(jīng)拼接后去掉兩端引物序列得到15個樣本序列長度均為655 bp，序列相似度高為99.84%，變異位點數(shù)3個。序列平均堿基組成情況為：T（39.2%）、C（18.2%）、A（30.0%）、G（12.6%），具較明顯AT偏向性。所獲序列在BOLD系統(tǒng)中進行初步比對，與其序列同源性最高的為喙薊馬屬Mycterothrips的種類（88.5%），證明所測片段為目標序列。對實驗獲取的DNA條形碼序列的遺傳距離分析（Kimura 2-parameter distances）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛腹喙薊馬6個地理種群的15個樣本種內(nèi)遺傳距離極小，為0.00% ～0.46%（表2）。

表2 基于Kimura 2P的貢山喙薊馬種內(nèi)遺傳距離Table 2 Intraspecific genetic distance of M. gongshanensis based on Kimura 2P

3 結(jié)論和討論

本文鑒定了一種廣泛發(fā)生于貴州茶園的重要薊馬害蟲——貢山喙薊馬M. gongshanensis，該蟲形態(tài)特征與另一種茶樹薊馬毛腹喙薊馬M.setiventris非常相似，但可從以下特征進行區(qū)分：（1）貢山喙薊馬前翅僅基部和端部色淡，而毛腹喙薊馬前翅中部常具一淺色域；（2）貢山喙薊馬后胸背板中對鬃位于前緣上，毛腹喙薊馬后胸背板中對鬃靠近；（3）貢山喙薊馬雄蟲陽基腹突端域并不膨大且腹部背板節(jié)IX后緣具1對非常小的結(jié)節(jié)而非粗的SB1鬃[4]。生產(chǎn)實踐中人們往往無法通過玻片標本特征對害蟲進行識別，本文提供了貢山喙薊馬的各蟲態(tài)生態(tài)照片，方便對該蟲進行初步鑒定。

除形態(tài)鑒定外，線粒體COI序列片段亦可輔助鑒定薊馬種類[24-26]。本文提交了貢山喙薊馬M. gongshanensis的線粒體COI數(shù)據(jù)（MT367384～ MT367392，MW288286 ～ MW288291）， 為該薊馬的分子鑒定以及遺傳多樣性研究提供了原始的分子數(shù)據(jù)參考。一般來講，2%的遺傳距離被認為是種間和種內(nèi)差異的一個界限[20]，本文中6個地區(qū)貢山喙薊馬M. gongshanensis的15個樣本種內(nèi)最大差異值（0.46%）遠小于界限值，且經(jīng)核實，本文提交的貢山喙薊馬M.gongshanensis的DNA條形碼數(shù)據(jù)與其模式標本完全吻合，說明數(shù)據(jù)真實有效。由于目前世界上已公布的關于喙薊馬屬昆蟲的分子遺傳信息極少，因此僅用線粒體COI序列不足以作為該蟲的鑒別依據(jù)。

此外，貢山喙薊馬除形態(tài)特征與毛腹喙薊馬相近外，二者發(fā)生為害特點也有許多共同點：均喜為害茶樹未展開或部分展開的芽頭，受害幼嫩芽葉正面褐化甚至芽頭脫落，每年9 ～ 10月份為害最為嚴重等[4,27]。

在對貢山喙薊馬的首次分類記述中，該害蟲就被認為可能是茶園一個潛在的害蟲[4]。通過近年來的調(diào)查，我們證實了其在貴州的廣泛分布并認為該蟲是貴州茶園一種重要吸汁性害蟲。鑒于該害蟲在貴州省的發(fā)生和為害現(xiàn)狀，亟待開展其在我國其它茶區(qū)的分布與為害情況調(diào)查、生物學與生態(tài)學特性、防治技術等方面的深入研究。