基于離子液體與超聲波輔助提取普洱茶茶多酚的工藝優化

萬 常，李啟慧，曾超珍，劉志祥

中南林業科技大學 生命科學與技術學院/林業生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004

茶多酚是茶葉中形成茶葉色香味的關鍵成分[1]。同時也是一種新型天然抗氧化劑，具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、降血壓、降血脂、提高機體免疫力等藥理和保健功能[2]。

離子液體被用于液-液萃取，由于離子液體具有蒸汽壓很低、可以忽略的揮發性、不可燃性、熱穩定性和選擇性溶解度等顯著特性，被認為是環境友好型的溶劑[3]。超聲波技術具有快速、節能、溶劑用量少、產品純度高并獲得更高的收率等優點[4]，超聲波輔助離子液體方法被廣泛應用于活性成分的萃取分離方面，如茶葉綠原酸[5]、菊花異綠原酸C[6]、白花葛莖和辣木葉多糖[7-8]、石榴籽原花青素[9]、杜仲皮總木脂素[10]、黃柏總生物堿[11]、黑豆異黃酮[12]、柚子皮、艾葉、銀杏葉及葛根總黃酮[13-16]等。

普洱茶（Camellia sinensis var. assamica）具有抗癌、抗血栓、抗氧化、助消化、降脂減肥和降血糖等功效[17-19]。普洱茶富含茶氨酸、茶多酚、咖啡堿及沒食子酸等[20]，其中沒食子酸、咖啡堿和茶多酚對其品質的影響很大[21]。迄今為止，還未見超聲波輔助離子液體提取普洱茶茶多酚的報道。

本試驗采用綠色環保溶劑離子液體（1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽，[BMIM]Br）為溶劑，采用響應面法優化超聲波輔助提取普洱茶中的茶多酚，探討其最佳提取工藝，以期為茶葉中茶多酚的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱茶（熟茶，市售），置于干燥箱中80℃烘干后，用高速組織搗碎機粉碎，過80目篩，密封保存備用。1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽（純度≥99%，默尼化工科技有限公司）。

1.2 設備與儀器

101-2AB型電熱鼓風干燥箱（北京中興偉業世紀儀器有限公司）；TG16KR型高速離心機（東旺儀器有限公司）；DS-1型高速組織搗碎機（上海左樂儀器有限公司）；HN-1000Y型超聲波細胞粉碎機（上海達洛科學儀器有限公司）；UV-752C型紫外可見分光光度計（廣東航信科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶多酚的提取

稱取0.5 g茶葉粉碎樣，加入一定比例的[BMIM]Br作為提取溶劑，超聲波提取一段時間后，4 000 r/min下離心10 min，收集濾液，離心，取上清液。在波長為540 nm處測定其吸光值，每組均重復3次。

1.3.2 茶多酚標準曲線制作

精準稱取茶多酚標準樣品5.0 mg，加入去離子水溶解，定容至50 mL（質量濃度0.1 mg/mL），此為標準溶液。分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL茶多酚標準溶液，加入dd H2O（4 mL）和酒石酸亞鐵溶液（5 mL，5 mg/mL），混勻后再加入磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），定容至25 mL。測定其吸光度（540 nm），每個處理重復3次。以吸光度為縱坐標與茶多酚濃度為橫坐標得到線性回歸方程：y = 0.621x+0.0233，R2 = 0.9991。

1.3.3 茶多酚提取率的測定

參考陳峰等的方法[22]，每個處理重復3次，計算平均值。

式中：X—普洱茶提取液中茶多酚的濃度，mg/mL；A—在波長為540 nm下測定吸光值；V—溶液定容體積，mL；n—溶液稀釋倍數；m—普洱茶茶粉的質量，g。

1.3.4 單因素試驗

考察[BMIM]Br濃度（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mol/L）、提取時間（10、15、20、25、30 min）、超聲波功率（300、400、500、600、700 W）和料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）對茶多酚提取效果的影響；各因素水平固定值為：0.3 mol/L [BMIM]Br，提取時間為20 min，料液比1∶20，超聲波功率為500 W。

1.3.5 響應面優化試驗

采用Design-Expert v8.0.6軟件，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理[23]。[BMIM]Br濃度為0.3 mol/L，以料液比（A）、提取時間（B）和超聲功率（C）三因素作為自變量，每個因素三個水平，以普洱茶茶多酚提取率為響應值設計響應面優化試驗。因素和水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.4 數據分析

采用Excel 2019進行數據統計，采用Design-Expert v8.0.6軟件進行響應面優化分析[23]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同[BMIM]Br溶液濃度對茶多酚提取率的影響

如圖1所示，[BMIM]Br溶液的濃度為0.2～ 0.4 mol/L時，普洱茶茶多酚的提取率隨其濃度的升高先上升后下降，濃度為0.3 mol/L時提取率最高；而當濃度高于0.4 mol/L后提取率呈緩慢上升的趨勢，這可能是由于在超聲波狀態下，超聲的空化效應、熱效應及機械攪拌等作用極大地增加了有效成分的溶解和擴散，其影響遠大于增加離子液體濃度。因此，從原料經濟效益角度出發，[BMIM]Br溶液濃度采用0.3 mol/L為宜。

圖1 離子濃度對普洱茶茶多酚提取率的影響Figure 1 Effect of ion concentration on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.1.2 不同提取時間對茶多酚提取率的影響

如圖2所示，不同提取時間對普洱茶茶多酚的提取率影響較大，在提取時間為10 ～ 30 min時，普洱茶茶多酚提取率呈現先升高后下降的趨勢，在提取時間為20 min時提取率最高。在提取時間20 ～ 30 min時普洱茶茶多酚的提取率有所下降，可能是由于提取過程中在過長時間的超聲波作用下導致浸提液溫度升高使得部分茶多酚被降解氧化，茶多酚含量減少；也可能是細胞內外有效成分含量已達到動態平衡，導致普洱茶茶多酚提取率降低。因此，超聲提取時間選擇20 min左右為宜。

圖2 提取時間對普洱茶茶多酚提取率的影響Figure 2 Effect of extraction time on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.1.3 不同超聲波功率對茶多酚提取率的影響

如圖3所示，超聲波功率為300 ～ 600 W時茶多酚的提取率隨著超聲波功率的增加而升高，600 W時達到最大值；之后隨著超聲波功率的增大茶多酚的提取率呈下降趨勢，其原因可能是隨著超聲波功率增大，溶液的振動頻率加快，有利于茶多酚的浸出，但功率過高振動過快時會引起溶液溫度的升高而降解部分茶多酚，造成茶多酚損失。因此本試驗超聲波功率選擇600 W。

圖3 超聲波功率對普洱茶茶多酚提取率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic power on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.1.4 不同料液比對茶多酚提取率的影響

從圖4可知，一開始增加提取溶劑的用量，茶多酚的提取率升高，并在茶葉與溶劑比為1∶30時提取率達到最大；此后，隨著增加提取溶劑，提取率緩慢降低。可能是開始溶劑用量較少，超聲波作用于茶葉較困難，茶多酚溶出速度慢，浸出率較低；后隨著提取溶劑用量的增加，茶多酚的提取率先上升后下降，呈現這種趨勢的原因可能是離子液體溶液達到一定用量后茶多酚基本萃取完全，再加大提取溶劑的用量時樣品中殘留的茶多酚也很難被萃取，且隨提取溶劑使用量增大，使得液體的粘度增大，擴散能力變差，溶液滲到樣品基質內部的難度加大，從而導致提取率下降。本試驗研究料液比選擇1:30。

圖4 料液比對普洱茶茶多酚提取率的影響Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 Box-Behnken中心組合試驗結果

在單因素分析試驗的基礎上，選擇[BMIM]Br溶液濃度為0.3 mol/L，以料液比（A）、提取時間（B）、超聲功率（C）三因素作為自變量，每個因素三個水平，以普洱茶茶多酚提取率為響應值設計響應面分析試驗。Box-Behnken中心組合試驗方案及結果如表2所示。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface test results

利用Design-Expert v8.0.6軟件對所得的試驗數據進行回歸整理，結果如表3所示。各因素經回歸擬合后，得到茶多酚提取率的二次多項式回歸模型：

茶多酚提取率（%）=-32.44312 + 0.33275×A+ 1.96550×B + 0.053250×C-7×10-4×A×B +7.25×10-5×A×C-2.15×10-4×B×C-5.85×10-3A2-0.0448×B2-4.325×C2。

由表3可知，F = 67.94，P < 0.0001，說明該模型極顯著，具有意義；失擬項不顯著（P=0.4984 > 0.05），表明該模型具有較高的擬合度，未知因素干擾小。模型的決定系數R2= 0.9887，校正決定系數，說明回歸方程相關性高，試驗誤差小，穩定性和可靠性較好，可有效分析和預測浸提茶多酚工藝參數。此外，分析結果表明一次項C和二次項A2、B2、C2均對響應值影響極顯著，一次項B表現為顯著。F數值越大，影響程度越大（FA= 2.97、FB=14.66、FC= 64.41）。

表3 回歸模型分析Table 3 Regression model analysis

2.2.2 Box-Behnken響應面分析交互作用

為了更直觀深入地探討各個因素間的交互作用，采用Design-Expert v8.0.6軟件繪制空間曲線圖與等高線圖進行直觀分析，結果如圖6 ～圖8所示。

從圖6 ～ 圖8可看出，在空間曲面圖中，曲面坡度越陡，表明因素間交互作用越強；在等高線圖中，封閉曲線越趨于橢圓表明因素間交互作用越強；同一橢圓形的曲線上茶多酚的提取率相同，中心點最高。由此可知，超聲波功率和提取時間對茶多酚提取率的交互效應較強，而提取時間和料液比對茶多酚提取率的交互效應次之，超聲波功率和料液比對茶多酚提取率的交互效應最弱。

圖6 提取時間和料液比交互作用Figure 6 Interaction between extraction time and solid-liquid ratio

圖7 超聲功率和料液比交互作用Figure 7 Interaction between ultrasonic power and solid-liquid ratio

圖8 超聲功率和提取時間交互作用Figure 8 Interaction between ultrasonic power and extraction time

從各因素影響程度分析，再結合各因素的F值，能反映出各參數對茶多酚提取率的影響大小，三個因素的影響為：C（超聲功率）> B（提取時間）> A（料液比）。

2.2.3 最佳提取工藝的確定與驗證

通過對回歸方程的求解，預測得到浸提茶多酚最佳提取工藝條件為：[BMIM]Br溶液濃度0.3 mol/L、料液比30 mL/g、提取時間20 min、超聲波功率590 W。在此條件下對普洱茶茶多酚進行提取，重復3次，茶多酚的提取率平均值為8.40%，與預測值8.36%接近，表明該模型提取條件參數可靠，響應面優化超聲波輔助法提取普洱茶茶多酚是可行的，該提取工藝具有一定的應用價值。

2.3 不同提取方法比較

結果如表4所示。離子液體相比于乙醇溶劑具有更好的溶解性，超聲波輔助提取茶多酚較傳統溶劑浸提法具有明顯優勢，提取率大大提高。

表4 不同提取方法對茶多酚提取率的影響Table 4 Effects of different extraction methods on the extraction rate of tea polyphenols

3 結論

本試驗以普洱茶為材料，選用離子液體（[BMIM]Br）為提取溶劑，結合超聲波輔助方法對[BMIM]Br濃度、提取時間、超聲功率、料液比進行單因素與響應面試驗，優化提取普洱茶茶多酚的最佳提取工藝條件。試驗結果表明，利用響應面法建立的回歸模型具有高度的顯著性，方程對試驗擬合較好，各個因素對普洱茶茶多酚提取率的影響大小為：C（超聲功率）> B（提取時間）> A（料液比），普洱茶茶多酚的最佳提取工藝為：0.3 mol/L [BMIM]Br溶液、料液比1∶30、超聲時間20 min、功率590 W。在此提取條件下，茶多酚提取率為8.40%，與預測值8.36%接近；由此可以得出，超聲波輔助離子液體提取普洱茶中茶多酚具有較高的得率。離子液體可作為提取溶劑應用于茶葉中茶多酚的提取，該工藝穩定、可行，可為普洱茶茶多酚的提取與開發利用提供參考。