濃茶汁的制備工藝及其解毒作用實(shí)驗(yàn)研究

謝 鋒，張宏杰，朱 華*

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2. 廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200

茶，味甘苦、微寒、無(wú)毒，李時(shí)珍在《本草綱目》中記載茶有利小便、去痰熱、下氣消食、清頭目等功效，可用于治療眼疾、風(fēng)化痰以及各種原因所引起的頭痛[1]。陳藏器在《本草拾遺》中記載“諸藥為各病之藥、茶為萬(wàn)病之藥”，說(shuō)明茶的功用頗多。茶葉在加工過(guò)程中化學(xué)成分的種類及含量均有不同程度的變化[2]。現(xiàn)代研究表明，茶葉中含有茶多酚、生物堿與茶多糖等多種成分，有降血壓、血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制病菌活性和提高人體免疫力、抗腫瘤等藥理作用[3]。茶葉的解毒作用，據(jù)考證最早見于1717年的《格致鏡源》，曰“神農(nóng)嘗百草，日遇七十二毒，得荼而解之”[4]。在少數(shù)民族聚居地，對(duì)誤服的有毒民族藥亦有用茶解毒的記載，如《云南中草藥》在昆明山海棠（掉毛草）項(xiàng)目下就有：“本品有劇毒，不可多服。中毒可用茶葉煎水服解救”[5]。目前關(guān)于“茶解藥毒”的考辯僅見于奚茜[6]等通過(guò)考證，認(rèn)為以茶解藥毒最早見于宋代《圣濟(jì)總錄》卷146“雜療門·中毒藥”篇，但是茶葉在解藥毒方中的“權(quán)重”并不大；總結(jié)出茶解藥毒的機(jī)理為以茶送服藥以通過(guò)利尿?qū)a或以茶葉濃煎催吐減少有毒物質(zhì)的吸收。藥物經(jīng)茶汁炮制后是否真的有減毒作用，現(xiàn)代研究尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其炮制減毒實(shí)驗(yàn)研究尚屬空白，缺乏茶汁制解毒的機(jī)制理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

三十六蕩為蘿藦科娃兒藤屬植物卵葉娃兒藤（Tylophora ovata（Linl）Hook.et Stend）的根及根莖，是一味傳統(tǒng)壯藥，壯名Gosamcibloegdang[7]，也稱娃兒藤，異名老君須、藤葉細(xì)辛、毛管細(xì)辛和落地蜘蛛等，有毒，具有行氣散瘀止痛和化痰止咳等功效，在民間具有多種藥用價(jià)值，除主要用于哮喘、慢性支氣管炎和毒蛇咬傷外[8-10]，還常用于癌癥的治療[11]，因其所含的娃兒藤生物堿具有顯著的抗腫瘤活性而受到廣泛關(guān)注。對(duì)三十六蕩的炮制，在《中國(guó)民族藥炮制集成》中明確記載了用茶汁制解毒：先將茶葉煎成濃汁，再將三十六蕩生品置缸中，噴入茶汁，悶潤(rùn)，曬干[12]。傳統(tǒng)認(rèn)為濃茶能引吐、消脂[13]，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)大部分都只是對(duì)茶汁進(jìn)行濃縮[14-15]，僅有2篇提到了濃茶汁[16-17]，即50 g茶葉加開水泡汁200 mL及每1 g茶葉用沸水量少于50 mL為濃茶。由于用茶汁制解毒的藥物較少，缺少參考，因此對(duì)記載中所用茶的種類和濃茶汁的具體制法和濃度等均有待研究。

為考察濃茶汁的制備方法，本實(shí)驗(yàn)將選用不發(fā)酵的綠茶、全發(fā)酵的紅茶和后發(fā)酵的黑茶為材料，以茶多酚為對(duì)照品，采用正交設(shè)計(jì)，優(yōu)選濃茶汁的制備工藝；同時(shí)，課題組前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三十六蕩藥材經(jīng)茶汁炮制后，其生物堿含量發(fā)生了不同程度的變化，為探討不同茶葉茶汁制三十六蕩的毒性變化，將選用不發(fā)酵的綠茶和發(fā)酵完全的紅茶分別與三十六蕩炮制，并測(cè)定三十六蕩炮制前后的LD50，比較其毒性的變化，為茶汁制三十六蕩的炮制工藝和深入研究茶汁制減毒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣為市售綠茶、紅茶和黑茶；三十六蕩藥材購(gòu)自藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)滕建北教授鑒定為蘿藦科（Asclepiadaceae）娃兒藤屬（Tylophora）植物卵葉娃兒藤（Tylophora ovata（Lindl）Hook. ex Steud.）的全草；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

UV-1780型紫外可見分光光度計(jì)（島津儀器有限公司）；SQP電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠，4 ～ 6周齡，雌雄各半，體重16 ～ 18 g，購(gòu)自湖南安生美藥物研究有限公司，合格證號(hào)SCXK（湘）2019-0004，實(shí)驗(yàn)前12 h小鼠禁食不禁水。

1.4 濃茶汁的制備

1.4.1 熱水浸提法

準(zhǔn)確稱取50 g茶葉，加入一定量熱水浸泡一定時(shí)間，反復(fù)提取三次，過(guò)濾，濾液濃縮轉(zhuǎn)移至容量瓶中備用。

1.4.2 水浴提取法

準(zhǔn)確稱取50 g茶葉，加入一定量的水，水浴鍋中加熱提取一定時(shí)間，反復(fù)提取三次，過(guò)濾，合并濾液濃縮后轉(zhuǎn)移至容量瓶中備用。

1.5 茶多酚含量測(cè)定

采用GB/T8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》中分光光度法測(cè)定[18]。

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以提取時(shí)間、料液比、提取溫度條件為考察因素，選用L9（33）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化最佳的濃茶汁提取工藝，因素水平見表1。

表1 濃茶汁提取工藝正交因素水平表Table 1 Level of orthogonal factors for extraction technology of concentrated tea juice

1.7 茶汁制娃兒藤炮制品的制備

取凈制后的三十六蕩藥材，切成小段，分別加定量的綠茶和紅茶濃茶汁，拌勻悶潤(rùn)后烘干。

1.8 供試品溶液的制備[19-20]

分別將三十六蕩原藥材和不同炮制品粉碎過(guò)篩，稱取一定量粉末于圓底燒瓶中，加入95%乙醇回流提取（物料比為1∶25）3次，每次2 h，合并濾液濃縮成浸膏。灌胃使用前加入與干膏等質(zhì)量的吐溫80將提取物溶解（比例為1∶1），加入適量的純水配置，密封備用。

1.9 急性毒性實(shí)驗(yàn)[21]

1.9.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)

取小鼠60只，體重20±2 g，雌雄各半，每組4只，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h。每個(gè)樣品按照不同濃度各選擇一組小鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每只小鼠均按照40 mL/kg灌胃給藥一次，分別觀察小鼠灌胃后4 d內(nèi)情況，記錄死亡時(shí)間，最后計(jì)算出各藥物的最高致死劑量（Dm，指剛好導(dǎo)致動(dòng)物全部死亡的劑量）、最低致死劑量（Dn，指剛好不引起動(dòng)物死亡的劑量）或最大給藥量，供LD50的測(cè)定實(shí)驗(yàn)參考。

1.9.2 正式實(shí)驗(yàn)

取小鼠170只，體重20±2 g，雌雄各半，每組10只，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h。各樣品提取物分別設(shè)置5個(gè)劑量組，藥物的稀釋配置為每個(gè)梯度為上一個(gè)梯度的0.7倍，每只小鼠均按照40 mL/kg給藥一次，3次/d，觀察7 d內(nèi)出現(xiàn)的中毒癥狀、死亡情況及各組動(dòng)物的死亡數(shù)，對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀察并記錄主要損害的器官及病理變化情況，計(jì)算出各樣品的LD50。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲線的測(cè)定結(jié)果

方法學(xué)研究結(jié)果表明，茶多酚含量在0.032～ 0.096 mg/mL與吸光度成良好的線性關(guān)系，Y = 8.12925X-0.0113780（r = 0.9996）。

2.2 濃茶汁提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，濃茶汁提取工藝中茶多酚提取率影響的主次順序?yàn)锽＞C＞A，其影響因素較大的為加水量，最小的是提取時(shí)間，最佳濃茶汁提取工藝為A3B3C2，即提取時(shí)間40 min、加水量400 mL、提取溫度95℃。

表2 濃茶汁提取工藝正交設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Orthogonal design results of extraction technology of concentrated tea juice

2.3 不同方法提取的濃茶汁的茶多酚含量

由表3可知，三種不同茶葉提取的濃茶汁，水浴提取和浸提法中茶多酚提取率均為綠茶＞黑茶＞紅茶，以水浴提取方法優(yōu)于浸提方法。

表3 濃茶汁中茶多酚含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of tea polyphenols in concentrated tea juice

2.4 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同炮制品對(duì)小鼠急性毒性的影響結(jié)果見表4，不同炮制品小鼠死亡情況的影響見表5。

表5 茶汁制三十六蕩不同炮制品提取物灌胃后小鼠的死亡情況Table 5 Death of mice after gavage of extracts from different processed products of Tylophora ovata made of tea juice

由表4可知，藥材經(jīng)過(guò)濃茶汁炮制后急性毒性作用變化的順序?yàn)椋杭t茶炮制品＞生品＞綠茶炮制品。實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠死亡時(shí)間集中在給藥后的第2 d和第3 d，且第2 d的死亡小鼠數(shù)量最多，未死亡小鼠一般在給藥后的第3 d開始恢復(fù)正常飲食及活動(dòng)；存活的小鼠7 d內(nèi)小便，被毛、膚色、鼻子、眼睛與口腔分泌物均沒(méi)有異常，體重呈自然增長(zhǎng)；灌胃后1 ～ 3 d小鼠大便顏色較正常小鼠大便深，呈深褐色；對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖，肉眼未發(fā)現(xiàn)異常現(xiàn)象。

表4 茶汁制三十六蕩不同炮制品提取物對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Acute toxicity test results of extracts from different processed products of Tylophora ovata made of tea juice

3 討論

3.1 濃茶汁的提取工藝

課題組根據(jù)文獻(xiàn)記載的濃茶汁制備方法進(jìn)行了預(yù)試，發(fā)現(xiàn)50 g茶葉加水200 mL，水量太少；茶葉提取3次，第一次沖泡會(huì)有80%的量被浸出，第二次會(huì)有15%，第三次沖泡后基本達(dá)到全量浸出[17]。因此，經(jīng)反復(fù)預(yù)試與篩選，在正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)確定了加水量及反復(fù)提取3次。

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，濃茶汁中茶多酚提取率正交的極性差異為料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。原因可能有以下幾個(gè)方面：一是在浸泡茶汁時(shí)，有部分的茶汁殘留在茶葉上沒(méi)有過(guò)濾出來(lái)；二是過(guò)濾時(shí)有茶葉的殘?jiān)氯麨V紙，需經(jīng)常更換濾紙，濾紙上也殘留部分的茶多酚，有可能導(dǎo)致茶多酚提取率的降低。有研究表明制茶工藝與提取溫度都會(huì)對(duì)茶多酚的含量有影響[22-23]，從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，以未發(fā)酵的綠茶水浴提取的茶多酚含量最高。

3.2 茶汁制三十六蕩急性毒性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三十六蕩經(jīng)綠茶汁炮制后有明顯的減毒效果，而經(jīng)紅茶汁炮制則表現(xiàn)出增毒效果。課題組同時(shí)還測(cè)定了三十六蕩炮制前后其主要毒效成分娃兒藤生物堿的含量（另文發(fā)表），通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)濃茶汁中的茶多酚含量越高，炮制后的娃兒藤生物堿含量就越低，相關(guān)的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

茶葉中主要含有生物堿、多酚類、芳香物質(zhì)和茶氨酸等化學(xué)成分以及多種維生素物質(zhì)、少數(shù)礦物質(zhì)和微量元素。茶葉能與植物堿發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成鹽，當(dāng)發(fā)生植物堿中毒時(shí)，多飲茶可以降低生物堿對(duì)機(jī)體的毒副作用[24]。藍(lán)宇敬[25]等通過(guò)對(duì)藥茶方劑的研究認(rèn)為，“茶解藥毒”說(shuō)明不是茶解毒后減低藥效，而是使用了茶的藥用價(jià)值，起到了增效減毒的作用。三十六蕩的毒效成分主要是生物堿，通過(guò)濃茶汁炮制，有可能會(huì)降低其游離生物堿濃度，使其更多以鹽的形式存在，因此采用濃茶汁炮制三十六蕩，可以達(dá)到減輕生物堿毒副作用，有一定的科學(xué)道理。但是三十六蕩中的總生物堿既是有毒成分，也是有效成分，因此經(jīng)過(guò)濃茶汁炮制后化學(xué)成分的變化和藥理藥效作用的變化，還有待更深層次的研究。