3個欒樹品種抗寒性比較及生理指標(biāo)變化

劉金秋,曹幫華，任永俊，王世棟，段正洪，高 莉，王桂苓，孫豐勝

（1.山東省地質(zhì)科學(xué)研究院，山東濟南250013；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 黃河下游森林培育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，山東泰安271001；3.淄博市沂源縣歷山街道辦事處，山東淄博256199；4.五蓮縣洪凝街道辦事處，山東日照262300；5.滕州市國有西崗苗圃，山東滕州277519；6.山東省國土空間規(guī)劃院,山東濟南250014；7.東平縣林種苗圃管理服務(wù)中心，山東東平271509）

欒樹又名燈籠樹，原產(chǎn)于我國中、北部地區(qū)，主要在江蘇、浙江，安徽、江西、河南大量種植，近年來在山東省城市綠化中廣泛應(yīng)用。欒樹為無患子科欒樹屬落葉喬木或灌木，為深根性植物，生長速度中等，樹形優(yōu)美，枝葉茂盛，是庭園遮蔭樹的良好樹種； 春季葉子幼嫩多呈紅色，夏季開滿黃花，到秋天葉色開始變黃，長出似燈籠的紫紅色果實，具有極高的觀賞價值；常作為優(yōu)良行道樹及園林景觀品種[1]。我國冬季低溫區(qū)域廣泛且差異較大，北欒在北方具有廣泛適應(yīng)性，南欒在北方由于低溫原因，限制了其推廣應(yīng)用，開展南欒抗寒良種選育及抗寒性研究對樹木引種栽培及選育具有重要意義。

目前欒樹抗逆性研究方面涉及抗旱性、抗寒性、抗滯塵、抗SO2等[1-5]，樹種間比較較多，欒樹品種間比較較少。王珊珊[1]、馮獻賓[2]、王巖[6]等對欒樹與其他樹種抗寒性進行了比較研究,但關(guān)于欒樹品種水平上的抗寒性研究很少。

低溫是限制植物分布和園林應(yīng)用的重要環(huán)境因子。采用人工冷凍處理測定植物抗寒生理指標(biāo)的變化來揭示和研究植物的抗寒性是目前較為常用的研究方法。本文以引種馴化選育的南欒優(yōu)良無性系 “滕選”4 號、5 號為研究對象，采取低溫脅迫方法，研究了2 個無性系抗寒性及其低溫脅迫下相關(guān)生理生化指標(biāo)的變化并與北欒進行了比較,以期為欒樹良種選育及推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020年12月下旬采集位于山東滕州市西崗國有苗圃欒樹“滕選”4 號、5 號及北欒長勢基本一致、無病蟲害、木質(zhì)化良好的1年生枝條，在0℃至4℃儲存待測。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗設(shè)計

低溫處理方法參照曹曉敏[9]等的方法，將采集的供試枝條用去離子水沖洗干凈，用吸水紙吸干，剪成15～20 cm 的枝段，用石蠟封閉剪口，按照品種貼標(biāo)簽，裝入自封袋，放入可控超低溫冰箱。依次設(shè)-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃共6 個處理溫度，以-5℃為對照。待冰箱降至設(shè)定溫度后保持12 h，取出第一批試材，并繼續(xù)將冰箱降至下一設(shè)定溫度后保持12 h,取出下一批試材，依次進行。將取出的試材在4℃環(huán)境下解凍12 h，測定電導(dǎo)率。在-5 ～-25℃之間測定超氧化物歧化酶 （SOD）、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛（MDA）的變化。每個指標(biāo)重復(fù)測定3 次。

1.2.2 指標(biāo)及測定方法

（1）相對電導(dǎo)率測定[3]

將處理后的枝條剪成0.1～0.2 cm 的小段（去除芽）。稱取0.5 g 放入試管中，加入40ml 去離子水在室溫下浸泡12 h 后待測。測定浸泡液的電導(dǎo)率S1，再將盛有浸泡液的試管置于沸水浴30 min,冷卻至室溫后測定浸泡液電導(dǎo)率S2，相對電導(dǎo)率＝（初電導(dǎo)值/終電導(dǎo)值）×100%。

（2）半致死溫度計算

通過Logitic 回歸方程y ＝k / (1+ae-bx),計算半致死溫度。其中:y 為相對電導(dǎo)率,x 為處理溫度、k 為細胞傷害率的飽和容量,a,b 為曲線方程的參數(shù)[11]。根據(jù)王國霞[12]等的方法,將k 設(shè)為100%,計算得出a、b 和決定系數(shù)R2的值,處理溫度與相對電導(dǎo)率曲線的拐點溫度，即為半致死溫度LT50＝lna / b。

（3）生理生化指標(biāo)測定

采用氮藍四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶(SOD)、酸性茚三酮法測定脯氨酸、蒽酮比色法測定可溶性糖、考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白、硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛( MDA)[13]。

1.2.3 數(shù)據(jù)的處理與分析

利用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)歸整理、作圖，SPSS 20.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，鄧肯（Duncant）方法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下相對電導(dǎo)率的變化及半致死溫度

低溫脅迫下相對電導(dǎo)率的變化見圖1，低溫脅迫下，3 個欒樹品種的相對電導(dǎo)率都呈不斷上升趨勢總體呈S 型曲線。。各品種電導(dǎo)率變化顯著，其中北欒增加幅度最小為88.69%（P＜0.05）,4 號增加幅度最大為194.08%（P＜0.05），5 號增加幅度居中為89.80%（P＜0.05）。

圖1 低溫脅迫下不同欒樹相對電導(dǎo)率的變化/ %

根據(jù)3 個欒樹品種在低溫脅迫下相對電導(dǎo)率的變化，通過Logistic 擬合回歸方程y＝k/(1+ae-bx),計算得出各品種的半致死溫度（LT50）見表1，欒樹各品種擬合相關(guān)系數(shù)的R2均在0.9 以上，擬合度較高。各品種的低溫半致死溫度表現(xiàn)出差異性，北欒低溫半致死溫度最低為-27.549℃，其次為 “滕選”4 號-20.895℃，最高為“滕選”5 號-18.723℃。3個欒樹品種抗寒性排序為北欒＞“滕選”4 號＞“滕選”5 號。

表1 3 個欒樹品種的半致死溫度

2.2 低溫脅迫下抗氧化酶SOD 活性的變化

隨著脅迫溫度的降低，欒樹各品種的SOD 含量如圖2所示，都呈先降低再升高再降低趨勢。其中，“滕選”4 號、5 號在-5～-10℃不斷降低，-10～-20℃后上升，北欒在-5～-15℃不斷降低，-15～-20℃后上升，所有欒樹SOD 含量在-20℃快速上升后降低。“滕選”4 號、5 號、北欒SOD 含量最高比最低分別增加了108.26%（P＜0.01）差異極顯著、81.56%（P＜0.01）差異極顯著、31.22%（P＜0.05）差異顯著。

圖2 低溫脅迫下不同欒樹品種SOD 活性的變化/(U·g-1)

2.3 低溫脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的變化

隨著脅迫溫度的降低，欒樹各品種的脯氨酸含量如圖3所示，“滕選”4 號、5 號呈先降低后升高趨勢，北欒則不斷升高。“滕選”4 號、5 號在-10℃前有所下降，-15℃后都持續(xù)升高，-15～-25℃之間增加緩慢，而北欒在-5～-10℃增加緩慢，-10～-15℃之間增加迅速，-15～-25℃之間增加緩慢，可能與-15℃之前北欒所受損傷低于“滕選”4 號、5 號，脯氨酸含量偏低，隨著傷害加重，脯氨酸含量急劇增高?！半x”4號、5 號分別比對照增加了136.56%（P ＜0.05）、129.01%（P＜0.05），差異顯著，北欒比對照增加了320.16%（P＜0.01），差異極顯著。

圖3 低溫脅迫下不同欒樹品種脯氨酸含量的變化/(mg·g-1)

低溫脅迫下，欒樹各品種的可溶性糖含量變化如圖4所示，隨著低溫脅迫的加劇，“滕選”4 號、5號可溶性糖含量均呈先上升后下降趨勢，在-20℃含量高于其他脅迫溫度。北欒可溶性糖含量呈不斷升高趨勢。其中，在-5～-20℃低溫處理階段內(nèi)，所有品種可溶性糖含量都呈上升趨勢，在-20～-25℃“滕選”4 號、5 號緩慢下降而北欒迅速增加，“滕選”4號、5 號、北欒相比較對照分別增加了211.18%（P＜0.01）、99.37%（P＜0.01）、112.21%（P＜0.01），均差異極顯著。

圖4 低溫脅迫下不同欒樹品種可溶性糖含量的變化/（mg·g-1）

低溫脅迫下，欒樹各品種的可溶性蛋白含量變化如圖5所示，隨著低溫脅迫的加劇，“滕選”5 號、北欒可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在-20℃含量高于其他脅迫溫度。“滕選”4 號可溶性糖含量呈不斷升高趨勢但在最低溫-25℃時含量仍未高于“滕選”5 號及北欒。在-5～-15℃低溫處理階段內(nèi)，所有品種可溶性蛋白含量緩慢增加，-15～-20℃迅速增加，之后“滕選”5 號、北欒至-20℃快速升高后下降明顯。“滕選”4 號呈持續(xù)增加趨勢。增加幅度上，“滕選”4 號、5 號、北欒分別比最低對照增加了1252.39%（P＜0.01）、1467.90%（P＜0.01）、1086.51%（P＜0.01），均差異極顯著。

圖5 低溫脅迫下不同欒樹品種可溶性蛋白含量的變化/（mg·g-1）

2.4 低溫脅迫下MDA 含量的變化

低溫脅迫下，欒樹各品種的MDA 含量變化如圖6所示，隨著低溫脅迫的加劇，各欒樹品種MDA含量均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。其中，“滕選”4 號、5 號在-5～-15℃低溫處理階段內(nèi)，含量升高，在-15℃之后下降。而北欒在-5～-20℃含量升高，自-20℃之后開始下降。各欒樹MDA 含量開始下降溫度都早于各品種的低溫半致死溫度。北欒MDA 含量開始下降溫度晚于其他兩品種。各品種MDA 含量最高值比對照分別增加了45.50%（P＜0.01）差異極顯著、28.30%（P＜0.05）差異顯著、51.47%(P＜0.01)差異極顯著。

圖6 低溫脅迫下不同欒樹品種MDA 含量的變化/（μmol·g-1）

3 討論與結(jié)論

低溫對膜的傷害主要表現(xiàn)在膜透性的改變，從而使細胞內(nèi)物質(zhì)大量向外滲透[14]。柳新紅等研究表明電導(dǎo)率的變化體現(xiàn)出質(zhì)膜受傷害程度以及所測材料的抗寒性大小，電解質(zhì)滲出率達50%得出的半致死溫度可以更加準(zhǔn)確反映植物的抗寒性[15]。相對電導(dǎo)率越小，抗寒性越強，反之，抗寒性越弱[16]。隨著溫度降低，各品種相對電導(dǎo)率不斷升高，“滕選”4號、5 號在-20℃已經(jīng)達到51.91%、52.82%，北欒在-30℃達到50.25%，細胞膜受到嚴重損害，北欒到達50%電導(dǎo)率的脅迫溫度更低，表明北欒相對“滕選”4 號、5 號更耐寒。通過Logistic 擬合回歸方程計算得出各品種的半致死溫度，3 種欒樹的低溫半致死溫度由低到高分別為北欒-27.549℃、“滕選”4號-20.895℃、“滕選”5 號-18.723℃。3 種欒樹抗寒性排序為北欒＞“滕選”4 號＞“滕選”5 號。2 個新選南欒無性系抗寒性仍未達到北欒水平，但從抗寒性來看，完全可以在山東省范圍內(nèi)栽培應(yīng)用。

SOD 是植物細胞重要的保護酶，其活性高低與植物抗寒性強弱有密切關(guān)系[17]。本研究中，各品種SOD 活性均呈先下降再升高再下降趨勢，在-5～-25℃低溫處理階段內(nèi)的峰值在出現(xiàn)在-20℃，但變化趨勢與王珊珊[1]不斷升高、馮獻賓[2]有所不同。

脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白是植物體內(nèi)低溫脅迫下重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[14]。低溫脅迫下大多數(shù)植物會通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加細胞液的濃度，降低滲透勢，借此提升抗寒能力[18]。本次研究表明，隨著低溫脅迫加劇，脯氨酸含量“滕選”4 號、5號先降低后升高，北欒持續(xù)升高，北欒上升幅度最大；可溶性糖含量“滕選”4 號、5 號先升高后降低，北欒持續(xù)升高；可溶性蛋白“滕選”5 號、北欒先升高后降低，“滕選4 號持續(xù)升高。各品種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)升高明顯，表明了其面對低溫脅迫的敏感性，低溫處理階段內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)升高后降低說明低溫脅迫對植物細胞造成了不可逆轉(zhuǎn)傷害，生理機能下降。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的總體變化趨勢與之前的研究變化相似[1,19]。

植物在逆境下細胞產(chǎn)生大量的自由基加劇細胞膜過氧化，使細胞膜破壞加劇。MDA 是脂膜過氧化的最終產(chǎn)物，是反映了細胞膜傷害的重要指標(biāo)[20]。本試驗MDA 含量呈先升高后降低趨勢，表明低溫超出試材的耐受能力，植物細胞受到傷害嚴重難以抵御嚴寒使生理機能紊亂MDA 下降。北欒開始下降溫度在-20℃低于“滕選”4 號、5 號-15℃，表明其脂膜過氧化導(dǎo)致生理機能下降的溫度低于 “滕選”4 號、5 號。MDA 含量都在低溫半致死溫度前開始下降，此結(jié)論和呂小軍等[17]對花椒抗寒中MDA 的變化一致。

本文研究在室內(nèi)通過人工降溫實現(xiàn)的，各品種低溫半致死溫度作為參考，實際生產(chǎn)應(yīng)用中3 個樹種抗寒性可能與試驗結(jié)果有一定誤差，可根據(jù)實際情況綜合判定。