磷石膏對煤矸石微生物肥料養分含量的提升效果研究

張景寧，李小軍，盛定紅，王應蘭，吉 俐，董麗敏，謝承衛

（貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽 550025）

我國作為煤炭開采大國，在煤炭開采過程中產生大量煤矸石，煤矸石通常堆存處置，未得到有效利用。這不僅會造成土地資源的浪費，還會污染環境［1］。以煤矸石作為原料制備微生物肥料，不僅可以提高作物產量，還能改善作物品質，降低病蟲害發生率，保護農田生態環境等［2］。

當前，煤矸石微生物肥料主要是以煤矸石為原料，采用單一解磷微生物制備［3］。此方法雖然提高了肥料中有效氮磷鉀含量，能提高農作物產量［4］，但對農作物的品質改善不顯著［5］，且對煤矸石中磷的解離效率較低，煤矸石肥料中w（有效磷）在118～185 mg/kg［6-7］。而有研究表明磷石膏可以降低土壤堿性［8］，間接地影響農作物的品質［9］。向煤矸石中摻雜磷石膏可以調整煤矸石的酸堿度，提升解磷菌對煤矸石的解磷效果。目前鮮有利用解磷菌處理摻雜磷石膏的煤矸石制備肥料的研究報道。本研究主要目的是探究磷石膏對煤矸石微生物肥料養分含量的提升效果。

1 材料和方法

1.1 菌種

研究所用的GZU-art01菌株是從廢棄煤渣草坪根際土壤提取，經過分離、培育、篩選而得到。

1.2 煤矸石和磷石膏樣品

1.2.1 煤矸石

研究所用煤矸石來自貴州省六盤水市煤矸石堆場，其主要成分見表1。

表1 煤矸石中主要礦物成分［6］ %

1.2.2 磷石膏

研究所用磷石膏為陳舊磷石膏，來自開陽磷礦磷石膏尾礦壩，pH約為4.2。由于磷石膏的pH過低，直接用細菌處理，會導致細菌存活率降低，故將磷石膏摻入煤矸石中再用細菌處理，以確保細菌的存活率。

1.3 方法

1.3.1 菌株提取分離

初篩：用無機磷固體培養基進行初篩。

復篩：以商業菌株巨大芽孢桿菌為對照菌株，用沙培法進行復篩，篩選出解磷效果好的菌株。

1.3.2 菌株鑒定

提取GZU-art01菌株的總DNA，并將其通過引物進行菌落聚合酶鏈式反應（即PCR擴增反應）［9］，反應條件見表2。

表2 PCR擴增反應條件

將獲得的PCR產物寄送至測序公司進行DNA序列測試。測序結果在NCBI基因庫中對比分析基因序列，使用MEGA5.05軟件基于鄰接法構建GZU-art01菌株的系統進化樹，并結合細菌生理生化實驗結果對細菌進行定種。

1.3.3 單因素實驗

（1）確定磷石膏的最佳摻比：按不同比例分別稱取煤矸石和磷石膏樣品，共計10 g。其中0表示純煤矸石樣品，100%表示純磷石膏樣品，測量摻入磷石膏后煤矸石中的有效磷含量。

（2）細菌的耐酸耐堿實驗：將細菌接種于不同pH的培養基中培養（24±2）h后，用未接種的LB液體培養基作空白對照，在600 nm波長處進行光電比濁測定，得出細菌在不同pH下的存活情況。

1.3.4 煤矸石肥料的制備

根據單因素實驗確定因素的變化范圍，設計GZU-art01菌株的L9（4）3正交實驗。根據正交實驗結果得到菌株處理煤矸石和摻雜磷石膏的煤矸石的最優條件，以此來制備煤矸石肥料。將菌株GZU-art01接種于LB固體培養基上培養至對數期末期后取出。然后在培養基中加入適量無菌水，用L型玻璃棒刮洗，將細菌制成菌懸液。GZUart01菌株菌懸液濃度調節至最優條件，將菌懸液與10 g煤矸石和摻雜30%磷石膏的煤矸石混勻，并用1 mol/L HCl和NaOH調節體系pH，放入35℃恒溫培養箱中培養相應時間后，取出于35℃烘干。

1.3.5 煤矸石肥料中有效氮磷鉀含量的測定

按照《土壤分析技術規范》［10］中方法對經細菌處理過的煤矸石及摻雜磷石膏的煤矸石進行養分測定，包含有效磷、速效鉀、水解氮。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌落形態、菌體形態

GZU-art01菌株在LB固體培養基上的菌落形態和菌體形態如圖1所示。

圖1 GZU-art01菌株的菌落形態和菌體形態

從圖1可知，GZU-art01菌株在LB固體培養基中的菌落為米黃色，不透明，菌落形態呈橢圓形，較濕潤。通過革蘭氏染色在顯微鏡下觀察，菌體較細，無芽孢，鑒定為革蘭氏陽性菌。細菌的掃描電鏡圖像顯示細菌形態為短桿狀，長度約1.8μm，菌體表面有細微螺旋狀褶皺。

2.1.2 細菌生理生化實驗

對GZU-art01菌株進行一系列生理生化鑒定（均用微生物生化鑒定管進行實驗），其結果見表3。

表3 GZU-art01菌株的生理生化特性

2.1.3 GZU-art01菌株的16SrRNA鑒定

根據DNA序列檢測結果，構建的GZU-art01菌株的系統發育進化樹如圖2所示，GZU-art01菌株與節細菌屬Arthrobacter bambusae KF150696在同一個分支上，具有較高的同源性，結合細菌生理生化實驗結果可以得出，挑選的菌株為Arthrobacter bambusae。

圖2 GZU-art01菌株的系統發育進化樹

2.2 單因素實驗

2.2.1 磷石膏的最佳摻比

不同磷石膏摻比下，煤矸石有效磷含量的變化見圖3。

圖3 摻入不同比例磷石膏后煤矸石的有效磷含量

從圖3可知，在磷石膏摻比為30%時，煤矸石有效磷含量最高，故確定磷石膏摻比為30%。

2.2.2 細菌的耐酸耐堿實驗

菌株的耐酸耐堿性如圖4所示。由圖4可知，提取出的細菌在pH為6和7時，細菌活性較好，更利于對煤矸石中磷的解離。

圖4 GZU-art01菌株的耐酸耐堿性

2.3 菌株解離煤矸石制備肥料

煤矸石中的磷主要以難溶形式的礦物存在，GZU-art01是一株好氧型解磷菌，能夠將煤矸石中的磷轉化為可供植物吸收的有效磷。煤矸石的粒徑、體系pH、細菌接種量及培養時間均能影響解磷效果。因此，設計如下正交實驗以探究GZU-art01處理煤矸石和摻雜磷石膏的煤矸石的最佳條件。

2.3.1 GZU-art01菌株解離煤矸石的正交實驗及結果

分別用GZU-art01菌株處理煤矸石和摻雜30%磷石膏的煤矸石，正交實驗結果見表4和表5。

表4 GZU-art01菌株處理煤矸石的正交實驗結果

據表4、表5可知，用GZU-art01菌株處理煤矸石的最佳條件為：pH=6.5，細菌接種量為9.730×107～1.278×108cfu/mL，煤矸石粒徑為0.250 mm，培養時間為1 d。各因素對結果的影響：細菌接種量＞培養時間＞煤矸石粒徑＞pH。處理摻雜30%磷石膏的煤矸石的最佳條件為：pH=7.0，細菌接種量8.340×107～1.095×108cfu/mL，煤矸石粒徑為0.250 mm，培養時間為3 d。各因素對結果的影響：培養時間＞煤矸石粒徑＞細菌接種量＞pH。對比可知在適宜細菌（GZU-art01）生存的pH條件下，摻雜磷石膏后培養時間對煤矸石解磷效果的影響增加，細菌接種量對煤矸石解磷效果的影響降低，這也從側面說明摻入磷石膏能夠促進煤矸石中磷的解離。

表5 GZU-art01菌株處理摻雜30%磷石膏的煤矸石的正交實驗結果

2.3.2 煤矸石肥料的制備及肥效指標測定

分別測定最佳工藝條件下，GZU-art01菌株處理煤矸石和摻雜30%磷石膏的煤矸石制備微生物肥料中的氮磷鉀含量，結果如圖5所示。圖中的“原樣”是未經任何處理的煤矸石樣品；“煤矸石”表示經GZU-art01菌株處理的煤矸石肥料；“后摻”表示用細菌處理煤矸石后再摻雜30%磷石膏制得的煤矸石肥料；“先摻”表示先摻雜30%磷石膏再用細菌處理制得的煤矸石肥料。

圖5 煤矸石肥料中氮磷鉀含量

由圖5可知，相比于未經細菌處理的煤矸石樣品，GZU-art01處理過的煤矸石肥料、細菌處理后摻雜磷石膏的煤矸石肥料、摻雜磷石膏后用GZUart01菌株處理的煤矸石肥料水解氮、有效磷、速效鉀均有較大提升。其中先摻雜磷石膏后用細菌處理制作肥料的方法，對提升煤矸石肥料中的氮磷鉀含量最顯著，較煤矸石原樣分別提升6.52倍、19.41倍、2.46倍，均高于后摻磷石膏和單一細菌處理的煤矸石肥料。

3 結論

（1）利用GZU-art01菌株處理煤矸石制備肥料，能夠提升肥料中氮磷鉀含量。（2）當磷石膏摻比量為30%時，有效磷含量最高。（3）先摻雜磷石膏后用GZU-art01細菌處理來制備肥料的方法，對煤矸石肥料中的氮磷鉀含量提升最顯著，較煤矸石原樣分別提升6.52倍、19.41倍、2.46倍。（4）摻雜磷石膏可以提升解磷菌對煤矸石的解磷效率，不僅提升煤矸石肥料中的有效氮磷鉀含量，還能提高煤矸石微生物肥料的品質。這也是對煤矸石和磷石膏資源化利用的一種新方式。